ASTM F895-25 琼脂扩散细胞培养法细胞毒性筛选的标准试验方法（中文）

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本国际标准依据世界贸易组织技术性贸易壁垒委员会颁布的《关于制定国际标准、指南与建议的原则的决定》所确立的国际标准化原则制定。

代号:F895-25

琼脂扩散细胞培养法细胞毒性筛选的标准试验方法¹

本标准以固定编号 F895 发布；编号紧随其后的数字表示最初采用的年份，如为修订版，则表示最近一次修订的年份。

括号内的数字表示最近一次重新批准的年份。上标希腊字母 ε（8）表示自上次修订或重新批准以来仅做了编辑性修改。

1.范围

1.1 本定性测试方法适用于各种形状的材料。当材料数

量有限时，此测试方法也适用。例如，如果测试样品中的

化学物质能够透过琼脂层扩散，那么可以将小型装置放置

在琼脂上，检查是否存在细胞生长抑制区。

1.1.1 本测试方法不适用于无法扩散至琼脂或琼脂糖层

的化学物质，也不适用于与琼脂或琼脂糖层发生相互作用

的化学物质。

1.1.2 虽然琼脂层可起到缓冲作用，保护细胞免受样本

的损害，但可能存在一些足够重的物质，会压缩琼脂层，

阻碍扩散或对细胞造成机械损伤。对于这些物质，本测试

方法并不适用。

1.2 之所以选择L-929 细胞系，是因为它在同类检测中

有着广泛的应用历史。这并非意味着使用该细胞系更优，

只是表明L-929 是一种成熟的细胞系，特性明确且易于获

取，在多个实验室中均表现出可重复的结果。

1.3 本标准中所给出的国际单位制（SI）单位值，包括

国际单位制中正式认可使用的单位值，应被视为标准。本

标准中未包含其他计量单位。

1.4 本标准无意涵盖其使用过程中可能存在的所有安全

问题（如有）。本标准使用者有责任在使用前建立适当的安

全、健康和环境规范，并确定适用的法规限制。

1.5 本国际标准是依据世界贸易组织技术性贸易壁垒委

员会发布的《关于制定国际标准、指南和建议的原则的决

定》中确立的国际公认标准化原则制定的。

2.参考文件

2.1 美国材料与试验协会标准：2

F748 材料和设备通用生物测试方法的选择规程

2.2 美国典型培养物保藏中心文件：

美国典型培养物保藏中心（ATCC）菌种目录

II3美国药典阴性对照塑料参比标准4

3.测试方法概要

3.1 细胞培养至培养皿形成单层后，吸出培养基，换

上含琼脂的培养基，使其凝固。将测试样品置于琼脂表

面，

以评估给定材料或设备的细胞毒性。如果测试样品中的有

毒成分/化学物质能够透过琼脂层扩散，可能会对琼脂层

下的细胞产生不利影响。此方法适用于低密度材料（薄膜

、纸张等）、液体以及高密度材料，因为如果将高密度材

料直接与细胞单层接触，可能会对细胞造成物理损伤。

4.重要性与用途

4.1 本测试方法有助于评估新材料和配方的细胞毒性潜力

，并可作为已定型医疗器械及组件质量控制计划的一部分。

4.2 本测试方法假定细胞毒性评估能提供有用信息，有助

于预测医疗材料和器械在人体临床应用中潜在的细胞毒性

，包括坏死反应。当仅考虑化学毒性时，细胞培养方法与

动物实验结果显示出良好的相关性，并且通常对细胞毒性

物质更为敏感。

4.3 某些在医疗器械中具有安全临床使用历史的生物材

料具有细胞毒性。本测试方法并不意味着

本测试方法由美国材料与试验协会（ASTM）F04 医疗和外科材料及器

械委员会管辖，并由 F04.16 生物相容性测试方法分委员会直接负责。

本版于 2025 年1月1日批准。2025 年1月出版。最初于 1984 年批准。

上一版于 2016 年批准，为 F895-11（2016）。DOI：10.1520/F0895-25。

2如需参考 ASTM 标准，请访问 ASTM 网站 www.astm.org 或通过

www.astm.org/contact 联系 ASTM 客户服务。如需了解 ASTM 标准年度

汇编卷的信息，请参阅 ASTM 网站上标准的文档摘要页面。

3第四版（1983年）现可从美国模式培养物集存库获取，地址：洛克

维尔市帕克劳恩大道12031号，邮编10892。美国国会图书馆编目号：76

-640122。

4.《美国药典》，现行版，马里兰州罗克维尔。.

F895-25

所有生物材料都必须通过此项检测才能被认为适用于临床

使用（F748 实验规程）。

5.设备

5.1 应使用以下仪器：

5.2 培养箱；能将培养物维持在 37±2℃、5±1%二氧化

碳和相对湿度大于 90%的环境中。

5.3 水浴，能够保持 37 ±2℃ 和 45 ±2℃ 的温度。

5.4 倒置相差显微镜，放大倍数分别为40 倍、 100 倍和

200 倍。

5.5 临床离心机，可达到 1000×g的离心力。

5.6 无菌一次性 150 平方厘米组织培养瓶

5.7 无菌组织培养皿，直径 35 毫米，深 10 毫米。

注释 1—建议使用塑料培养皿，因为其表面平整，有利于

形成均匀的单层细胞。

5.8 无菌、一次性、离心管。

5.9 无菌移液管，1毫升、5毫升和 10 毫升。

5. 10 用于液体评估的直径为 10 毫米的过滤盘。

注意2—经发现，密理博AP2501000 过滤盘在细胞毒性评

估中使用效果良好，因为其不会引起细胞病变效应。其他

不会引起细胞病变效应的过滤盘也可使用。

注意 3：层流工作区能够过滤掉直径大于 0.3 微米的

99.99%的所有颗粒，或者可能需要 100 级洁净室来防止培

养物受到污染。

6.试剂

6.1 应使用以下试剂：

6.1.1 细胞培养维持液：1×培养基。将 90 毫升Eagle 最低

必需培养基（含 Earle 盐，不含L-谷氨酰胺）与 5至10 毫

升胎牛血清和 1毫升 100×非必需氨基酸溶液（含L-谷氨

酰胺）混合，将溶液调至 pH值7.2。

6.1.1.1 配制好的 MEM 开口容器可在 2至8℃条件下保

存，保存时间不超过两周。但为延长保质期，配方中应不

加谷氨酰胺。使用前，每 100 毫升 MEM 中加入 1毫升 L-

谷氨酰胺溶液（见 6.1.3）。

6.1.1.2 可在培养基中添加抗生素，如每毫升含 10000 国

际单位的青霉素 G和每毫升含 10000 国际单位的链霉素，

以降低细菌污染的发生率。每 100 毫升培养基中加入 1毫

升抗生素。应注意确保抗生素不会对细胞培养物的存活率

产生不利影响。

6.1.2 对于琼脂培养基覆盖法，需配制 2× 培养基（最终

体积 100 毫升）。将 20 毫升 10×Eagle's MEM（含 Earle'

s盐，不含 L-谷氨酰胺）、0.22 克碳酸氢钠（缓冲液）和

无菌蒸馏水混合至 70 毫升，将 pH 值调至 7.2。加入20 毫

升胎牛血清和 2毫升 100× 非必需氨基酸（含L-谷氨酰

胺）。用无菌蒸馏水定容至 100 毫升。

对2× 培养基进行过滤除菌。与等量的无菌 3% 琼脂混合

，使培养基的最终浓度为 1×。

6.1.3 L-谷氨酰胺溶液（冻干粉

），

29.2 毫克/毫升。用无菌蒸

馏水复溶。（冷冻保存。）

6.1.4 无钙镁汉克斯平衡盐溶液（室温保存）。

6.1.5 胰蛋白酶， 0. 1% 溶液，溶于汉克斯平衡盐溶液或无

钙镁的磷酸盐缓冲盐水（冷冻保存）。

6.1.6 应使用无菌、去离子或蒸馏水。

6.1.7 3% 琼脂糖；3%。

6.1.8 中性红染液，0.01%（重量比

），

溶于磷酸盐缓冲盐水

中。

6.2 所有试剂均应为组织培养级或同等规格。

6.3 应按照制造商的说明，采用无菌技术配制试剂。

7.细胞培养

7.1 本试验所用细胞培养物应为美国典型培养物保藏中

心（ATCC）的 CCL-1（NCTC 929 株，即 Strain L 小鼠结

缔组织的克隆），代号为 L-929。也可考虑使用其他经验

证的合适细胞系。应定期检测细胞是否受到支原体污染。

实验室应根据支持性数据确定细胞传代或倍增的上限，以

防止使用老化细胞进行本试验，因为老化细胞可能会出现

表型异常，从而影响形态学评估。

8.控制材料

8.1 应按照第 10 节的要求，使用在本试验中始终能引起

极微弱细胞反应的材料（例如，USP 阴性对照塑料参考标

准）制备阴性对照样品。

8.2 按照第 10 节的要求，使用能始终引发细胞毒性反应

的材料（例如乳胶橡胶）制备阳性对照样本。

8.2.1 橡胶乳胶是一种广泛使用的阳性对照材料，在多个

实验室中均表现出可重复的结果，并能形成毒性区域。

9.通用技术

9.1 在整个检测过程中均采用无菌技术以尽量减少微生物

污染。

注意 4：移液时切勿用嘴吸取细胞、培养基或试剂。

9.2 在将所有溶液和材料与细胞接触之前，应将其加热至

37 ±2℃。

9.3 用清洗液彻底清洗所有玻璃器皿，然后用大量去离子

水彻底冲洗干净。

9.4 使用前，用消毒溶液清洁所有工作台面。

9.5 记录细胞的培养历史。

9.6 应定期对标准培养物进行支原体污染的筛查。

F895-25

10.标本制备

10.1 采用适合器械最终用途的方法对所有样本进行灭菌。

10.2 若设备足够小（见 10.3 和10.4），能放入培养皿中

并留出足够的细胞边缘用于评估，则将整个设备作为样本。

10.3 将大型固体材料和器件沿横截面切开，获得面积为

100 至250 平方毫米的平面，使其与琼脂表面直接接触。

10.4 对于不平整的物品以及管状或棒状材料和装置，可

将其切成横截面，并横向放置，以在琼脂表面形成一个覆

盖面积为 100 平方毫米的平整测试面。

10.5 对于表面不规则或复杂的材料或设备，例如树脂、

颗粒或具有多孔或复杂形状的成型件，可将其放置在琼脂

层上，使其在琼脂层上覆盖的面积尽可能均匀，且总面积

为100 平方毫米。

10.6 从较大医疗用品上获取样本时，应从横截面相对较

大的部位取样，以暴露内部材料。

10.7 若器械由两种或两种以上材料制成，且这些材料旨

在接触体液或组织，则应从材料的交界处切割测试样本，

或者分别对每种材料进行测试，或者两者都进行。

10.8 准备用于评估液体或提取物细胞毒性的样本时，将

无菌滤纸片浸透，让多余液体自然沥干，同时保持无菌状

态。将浸透的滤纸片用作测试样本。

注意5—当使用环氧乙烷或其他化学灭菌剂时，应留出

足够的通风时间，以使可能对本检测结果产生不利影响的

残留物消散。通风时间应根据灭菌验证程序中确定的残留

物消散时间来确定。

注意 6—通常，应采用无菌技术制备样本。如果样本非

常坚硬（例如陶瓷），则应注意清除切割工具在新切面上

可能留下的残留物。在评估最终无菌包装中医疗材料或器

械的细胞毒性潜力时，必须避免重新灭菌、进一步处理或

在打开包装与开始测试之间出现延迟。对于小件物品，整

个无菌包装的内容物均可作为测试样本。当无菌包装中的

物品过大时，必须获取适当且具有代表性的小型样本。本

检测方法仅适用于小件物品或可采用无菌技术切割和重塑

的物品。

10.9 本方法中所测试的吸水材料应预先用培养基浸湿，以

防止琼脂中的水分流失以及随后对细胞造成损害。

11.4 抽吸冲洗液。

11.5 向培养瓶中加入足量的 0. 1% 胰蛋白酶溶液（约 5 毫

升），以覆盖细胞单层。

11.6 孵育 5 至 10 分钟以使细胞分离。

11.7 将细胞悬液转移至离心管中。

11.8 以 1300×g 离心 6 分钟。

11.9 倒掉上清液。

11. 10 将细胞重新悬浮于 10±0.1 毫升新鲜培养基中，并

充分混匀悬浮液。

11.11 将细胞悬液平均分装到2 至 8 个 150 平方厘米的组

织培养瓶中。

11.12 加入足量的新鲜培养基，使每个烧瓶中的培养基总

量约为50 毫升。

11. 13 每隔2 至 3 天更换一次培养基，直至单层细胞接近

融合，然后重复步骤 11.2 至 11.12。

12. 细胞层制备

12.1 按照以下步骤制备融合的细胞单层：

12.2 按照步骤 11.1 至 11.9 准备细胞悬液。

12.3 向每个培养皿中加入 2.0±0.1 毫升培养基。

12.4 用无菌的 10 毫升移液管向每个培养皿中加入 5 至 7

滴细胞悬液。转动培养皿以确保细胞分布均匀。

12.5 在显微镜下观察，培养至形成近融合的单层细胞。

注意7—形成近乎融合的单层细胞通常需要 3 至 5 天。

通过血细胞计数器计数细胞（以确保接种物的浓度），

可调节单层细胞形成所需的时间。每 35 毫米培养皿接

种 2 毫升，细胞浓度约为 1 × 10囚个细胞/毫升，通常

可在 4 天内形成近乎融合的单层细胞。各实验室在执行

测试方法时应确定细胞接种密度和达到近乎融合所需的

时间。

12.6 若在完成步骤 12.3 后细胞悬液仍未使用，可按每

毫升细胞悬液加入 9 毫升新鲜培养基的比例，将其加入

细胞培养瓶中，培养瓶的表面积约为每毫升稀释细胞 3

平方厘米，然后培养至形成近融合的单层细胞，这一

情况可通过显微镜检查确定。

13.测试程序

13.1 按照以下步骤进行琼脂扩散细胞毒性试验：

13.2 用显微镜检查细胞培养物，若细胞单层融合度不

正确或细胞出现颗粒状或脱落现象，则应予以弃用。

11. 细胞培养维护

11.1 请按照以下步骤通过连续传代培养来维持细胞：

11.2 用吸管将培养面积为 150 平方厘米的细胞培养瓶中的

培养基吸出，该培养瓶中含有一层接近融合的单层细胞。

11.3 用足够量（例如 5至10 毫升）的汉克斯平衡盐溶液冲

洗细胞，以去除残留的血清。

13.3 将 3% 的诺贝尔琼脂在 121℃ 的高压灭菌器中灭

菌 15分钟。

13.4 将高压灭菌后的琼脂放入 45℃的水浴中使其冷却

至 45℃。

13.5 将 2 ×MEM 放入 45℃的水浴中，使其升温至

45℃。切勿让培养基在 45℃下停留超过 1 小时。

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标签： #ASTM #细胞培养 #标准试验方法

摘要：

1本国际标准依据世界贸易组织技术性贸易壁垒委员会颁布的《关于制定国际标准、指南与建议的原则的决定》所确立的国际标准化原则制定。代号:F895-25琼脂扩散细胞培养法细胞毒性筛选的标准试验方法¹本标准以固定编号F895发布；编号紧随其后的数字表示最初采用的年份，如为修订版，则表示最近一次修订的年份。括号内的数字表示最近一次重新批准的年份。上标希腊字母ε（8）表示自上次修订或重新批准以来仅做了编辑性修改。.1.范围1.1本定性测试方法适用于各种形状的材料。当材料数量有限时，此测试方法也适用。例如，如果测试样品中的化学物质能够透过琼脂层扩散，那么可以将小型装置放置在琼脂上，检查是否存在细胞生长抑制区...

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