美国药典 USP 2025〈85〉细菌内毒素试验

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状态：当前状态为正式生效，生效日期为2025年2月12日
生效日期：自2018年5月1日起生效
文件类型：通用章节
文档ID：GUID-F9D9BFA5-099F-452C-9711-47674B37C1CC_2_en-US
DOI：https://doi.org/10.31003/ USPNF_M98830_02_01
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⧫本总则章节的部分内容已与《欧洲药典》和/或《日本药典》的相应文本保持一致。未与之统一的部分均以符号（◆）标示，以明确这一事实
〈85〉细菌 内毒素试验
。
细菌内毒素检测法（BET）是一种利用鲎（Limulus polyphemus 或Tachypleus tridentatus）的阿米巴细胞裂解液来检测或定量革兰氏阴
性菌内毒素的检测方法。
该检测共有三种技术方法：基于凝胶形成的凝胶凝固法；基于内源性底物裂解后浊度显现的比浊法；以及基于合成肽-显色剂复合物裂解后
颜色显现的显色法。可采用上述三种方法中的任意一种进行检测。如存在疑问或争议，除非被测产品的专论中有特别说明，最终判定应依据
凝胶凝固限值法结果。检测操作过程中须采取措施避免内毒素污染。
装置
⧫
反应条件为：温度250°C，时间30分钟。若使用塑料装置（如微孔板及自动移液器的移液管尖端），应选用经证实不含可检测内毒素且不会
干扰实验的装置。[注——本章中，“试管”一词包括任何其他容器，例如微孔板孔。]
REAGENTSAND 测试解决方案
阿米巴细胞裂解液
本产品为从鲎（Limulus polyphemus 或Tachypleus tridentatus）阿米巴细胞（白细胞）裂解液中制备的冻干制品。该试剂仅指符合相关
主管部门法规要求生产的制品。[注：阿米巴细胞裂解液除可检测内毒素外，还能与某些 β-葡聚糖发生反应。市面上有不与葡聚糖反应的阿
米巴细胞裂解液制剂：这些制剂通过去除裂解液中与葡聚糖反应的G因子，或抑制其G因子反应系统制备而成，可用于含葡聚糖条件下的内
毒素检测。]
细菌内毒素检测（BET）用水
使用注射用水或其他制备过程中产生的水，且该水在试剂检测限范围内与所用裂解液无反应。
裂解液 TS
将阿米巴细胞裂解液溶于水中用于BET实验，或使用裂解液制造商推荐的缓冲液，并进行轻柔搅拌。按制造商说明书要求，将复溶后的裂解液
冷藏或冷冻保存。
溶液的制备
标准内毒素储备溶液
标准内毒素储备液应使用经校准至现行世界卫生组织（WHO）内毒素国际标准的USP内毒素参考标准品制备。制备和储存标准内毒素储
备液时，请严格遵循包装说明书及标签上的操作规范。内毒素以内毒素单位（EU）表示。[注：1 USP内毒素单位（EU）等于1国际单位
（IU）的内毒素。]
标准内毒素溶液
将标准内毒素储备溶液充分混合后，使用BET纯化水制备标准内毒素溶液的相应系列稀释液。应尽快使用这些稀释液，以避免因吸附导致活性损失。
示例解决方案
通过使用水溶解或稀释药物来制备样品溶液，用于BET测试。某些物质或制剂可能更适合溶解于其他水溶液中。如有必要，应调整待检测溶
液（或其稀释液）的pH值，使裂解液与样品溶液混合后的pH值落在裂解液制造商规定的范围内（通常为6.0–8.0）。可根据裂解液制造商的建
议，使用酸、碱或合适的缓冲液来调节pH值。酸和碱可用于此目的。
⧫ ⧫
采用经过验证的工艺，在热风烘箱中对所有玻璃器皿及其他耐热材料进行除热原处理。 这是常用的最低要求。◆
OFFICIAL
2025年2月12日下午2:15
USP- NF 〈85〉 细菌内毒素检测
该样品由浓缩物或固体与水配制而成，用于BET测试，容器中不得检出内毒素。缓冲液必须经过验证，确保不含可检测的内毒素及干扰因子。
最大有效稀释度（MVD）的测定
最大有效稀释度是指样本可测定内毒素限值时允许的最大稀释度。根据以下公式计算最大有效稀释度（MVD）：
MVD =（内毒素限值 ×样品溶液浓度）/（λ）
内毒素限值
按每公斤体重计算，M值等于该产品按每公斤体重给药的最大推荐推注剂量。当产品需频繁注射或持续输注时，M值即为单小时内给予的最大
总剂量。肠外给药药物的内毒素限值在各专题报告中以特定单位规定，例如EU/mL、EU/mg、EU/生物活性单位等。
样品溶液的浓度
mg/mL：内毒素限值以重量表示（EU/mg）；
单位/mL：当内毒素限值以生物活性单位（EU/单位）表示时；
mL/mL：当内毒素限值以体积（EU/mL）表示时。
λ：凝胶凝块技术中的标示灵敏度（单位：EU/mL），或浊度测定法/显色法标准曲线中使用的最低浓度。
凝胶-血凝技术
凝胶凝块技术用于检测或定量内毒素，其原理是基于内毒素存在时裂解液试剂发生凝固反应。在标准条件下，引起裂解液凝固所需的最低内
毒素浓度即为该裂解液试剂的标记灵敏度。为确保检测的精确性和有效性，请按照下文“预备测试”部分所述方法，进行测试以确认裂解液的
标记灵敏度及干扰因素。
预备测试
标记裂解液敏感性确认试验
需通过四次重复实验确认标记灵敏度 λ（以EU/mL为单位）——该数值为试剂使用前裂解液的测定值。当使用新批次裂解液或测试条件
发生可能影响测试结果的变更时，必须进行裂解液灵敏度的确认测试。制备标准溶液时，应使用BET用纯水稀释 ，获得
至少四个浓度分别为 2λ、λ、0. 5λ和0. 25λ的标准溶液。
将一定体积的裂解液TS与等体积（例如0.1 mL等分试样）的标准内毒素溶液分别加入各试管中。若使用含有冻干裂解液的单支测试瓶或
安瓿瓶，则直接向瓶中加入溶液。按照裂解液制造商的说明（通常为37±1°C、60±2分钟）将反应混合物孵育固定时间，避免振动。为检测
凝胶完整性，依次从孵育箱取出各试管，以平稳动作将其翻转约180°。若形成牢固且翻转后仍保持原位的凝胶，则记录为阳性结果；若未形
成完整凝胶，则为阴性结果。当所有重复测试中标准溶液的最低浓度均显示阴性结果时，该检测被视为有效。
终点浓度是指在一系列递减浓度的标准内毒素中，能使裂解液发生凝固的最低浓度。几何平均终点浓度的计算方法如下：先计算四个
重复实验系列终点浓度对数值的平均值，再对该平均值取反对数，具体公式如下：
几何平均终点浓度 =反对数(Σe /f)
其中 Σe表示所用稀释系列终点浓度的对数之和，f为重复试管的数量。几何平均终点浓度即为裂解液的实测灵敏度（单位：EU/mL）。若该
值不低于0. 5λ且不高于 2λ，则表明标记灵敏度成立，可在使用该裂解液进行的检测中采用。
干扰因素检测
通常按照表1所示方法制备溶液（A–D），并在稀释度低于最小有效剂量（MVD）、且不含任何可检测内毒素的条件下，对样品溶液进行
抑制/增强测试，操作步骤参照标记裂解液敏感性确认试验所述方法。溶液B和C的几何平均终点浓度采用标记裂解液敏感性确认试验中规定
的公式计算。若任何可能影响测试结果的条件发生变化，必须重复干扰因素测试。
表1. 凝胶凝块技术抑制/增强试验溶液的制备
肠外给药药物的内毒素限值（基于剂量定义）等于 K/M ◆，其中 K为内毒素的热原性阈值剂量◆。
OFFICIAL
2025年2月12日下午2:15
USP- NF 〈85〉 细菌内毒素检测
解决方案
内毒素
浓度/
解决方案
内毒素
已添加 稀释剂
稀释
因子
内毒素
浓度
数量；数目
重复样本
啊无/样本
解决方案
BB 2λ/样品溶液 样品溶液 λ
λ
λ
λ
群发邮件 2λ/水用于 BET BET实验用水 λ
λ
λ
λ
DD 无/水用于 BET 测定
方案A：待测制剂的样品溶液，不含可检测内毒素。
方案B：干扰测试。
方案C：对标记裂解液敏感性进行控制。
方案D：BET实验用水的阴性对照。
当溶液A和D的所有重复样本均未显示反应，且溶液C的结果证实了标示的灵敏度时，该检测被视为有效。
若在溶液B存在下测定的裂解液灵敏度不低于0. 5λ且不高于 2λ，则样品溶液在所用实验条件下不含干扰因子；反之，待检测的样品溶
液会对测试结果产生干扰。
如果受试样本在低于最小有效稀释度（MVD）的稀释度下不符合检测要求，则应使用更高的稀释度重复检测，且该稀释度不得超过
MVD。采用灵敏度更高的裂解液可实现更高的样本稀释度进行检测，这有助于消除干扰因素。
可通过适当的处理方法（如过滤、中和、透析或加热）消除干扰。为确认所选处理方法能有效消除干扰且不导致内毒素损失，需使用
待检测样品进行上述检测方法：先向样品中添加标准内毒素，随后对其进行所选处理。
极限试验
程序
按照表2所示配制溶液A、B、C和D，并按照上述制备试验程序对这些溶液进行标记裂解液敏感性确认试验。
表2. 凝胶凝块限值试验溶液的制备
解决方案
内毒素浓度/所用溶液
添加了内毒素 重复次数
无/稀释样品溶液
2λ/稀释样品溶液
2λ/水用于 BET
无/水用于 BET 测定
OFFICIAL
2025年2月12日下午2:15
USP- NF 〈85〉 细菌内毒素检测

标签： #细菌内毒素 #内毒素 #USP

摘要：

状态：当前状态为正式生效，生效日期为2025年2月12日生效日期：自2018年5月1日起生效文件类型：通用章节文档ID：GUID-F9D9BFA5-099F-452C-9711-47674B37C1CC_2_en-USDOI：https://doi.org/10.31003/USPNF_M98830_02_01DOIRef:m30r7©2025USPC请勿分发⧫本总则章节的部分内容已与《欧洲药典》和/或《日本药典》的相应文本保持一致。未与之统一的部分均以符号（◆）标示，以明确这一事实〈85〉细菌内毒素试验。.细菌内毒素检测法（BET）是一种利用鲎（Limuluspolyphemus或Tachy...

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