ASTM F1984-25用固体材料检测血清中完整补体激活的标准试验方法（中文）

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本国际标准是依据世界贸易组织技术性贸易壁垒委员会发布的《关于制定国际标准、指南和建议的原则的决定》中确立的国际公认标准化原则制定的。
Designation:F1984-25
INTERNATIONAL
用固体材料检测血清中完整补体激活的标准试验方法 ¹
本标准以固定编号 F1984 发布；编号紧接在编号之后的数字表示最初采用的年份，如为修订版，则表示最近一次修订的年
份。括号内的数字表示最近一次重新批准的年份。上标字母 ε（e）表示自上次修订或重新批准以来仅做了编辑性修改.
1. 范围
1.1 本规程提供了一种快速的体外筛选方法， 用于检测用
于制造将与血液接触的医疗器械的固体材料的整体补体
激活特性。
1.2 本规程旨在评估拟与血液接触的固体材料在体外急性
激活补体的特性。在本规程中， “血清”和“补体 ”这两
个词可互换使用（大多数生物制品供应公司提及用作补体
来源的血清时， 这两个词也是同义的）。
1.3 本规程包含两个程序部分。程序 A描述了将固体材料
暴露于标准人血清批次的方法， 使用 0.1 毫升血清/13×100
毫米一次性试管。 以醋酸纤维素粉末和纤维为例作为测试
材料。程序 B描述了对暴露后的血清进行检测， 以确定其
与对照样本相比是否存在显著的功能性全补体耗竭。
1.4 本规程不涉及补体各成分的功能、精制或耗竭， 也不
涉及血浆作为补体来源的使用。
1.5 本规程是用于评估材料生物相容性的若干规程之一。
规程 F748 可为选择测试材料其他生物相容性方面的适当
方法提供指导。
1.6 本标准中所列的国际单位制（ SI）单位值应视为标准
值。本标准未包含其他计量单位。
1.7 本国际标准是依据世界贸易组织技术性贸易壁垒委
员会发布的《关于制定国际标准、指南和建议的原则的决定》
中确立的国际公认标准化原则制定的。
1该实践由美国材料与试验协会（ASTM）F04 医疗和外科材料及器械委员
会管辖，并由 F04.16 生物相容性测试方法分委员会直接负责。
本版于 2025 年2月15 日批准，2025 年3月出版。最初于 1999 年批准。
上一版于 2018 年批准，编号为 F1984-99(2018)。DOI：10.1520/F1984-25.
2.参考文件
2.1 美国材料与试验协会标准：2
F748 材料和设备生物测试方法的选择规程
2.2 ISO 文件：3
ISO 10993-4 医疗器械生物学评价 第 4部分
4：与血液相互作用的测试选择
3.术语
3.1 缩略语：
3.1.1 Ab—抗体（溶血素）
3.1.2 巴比妥缓冲盐水（BBS）
3.1.3 BBS-G——巴比妥缓冲盐水——明胶。
3.1.4 BBS-GM——巴比妥酸盐缓冲生理盐水——明胶金属。
3.1.5 C'—补集。
3.1.6 乙二胺四乙酸二钠盐 ：二水合物。
3.1.7 HS—人血清。
3.1.8 聚偏二氟乙烯（PVDF）
3.1.9 红细胞（RBC）
4.实践总结
4.1 固体材料试样在规定条件下与标准补体批次接触（
程序 A）。然后将接触后的血清与相同条件下接触的对
照血清进行比较， 检测其功能补体是否显著减少（程序
B）。
5.重要性与用途
5.1 血液接触型医疗设备不适当激活补体可能会对宿主
产生严重的急性或慢性影响。这种做法作为一种简便、
经济的体外检测方法， 可用于确定固体材料对完整补体
的功能激活情况。.
2对于所引用的 ASTM 标准，请访问 ASTM 网站 www.astm.org 或联系
ASTM 客户服务，网址为 www.astm.org/contact。有关 ASTM 标准年度汇编卷
的信息，请参阅 ASTM 网站上标准的文档摘要页面.
3可从美国国家标准协会（ANSI）获取，地址：纽约州纽约市第 43 街25 号4
楼，邮编 10036，网址：http://www.ansi.org 。
版权◎ASTM 国际，100 巴尔港大道，邮政信箱 C700，西康舍霍肯，宾夕法尼亚州 19428-2959。美国
2
F1984-25
5.2 本操作方法由两部分组成。在 A部分（第 11 节），将
人血清暴露于固体材料。补体可通过经典途径或替代途径
被耗尽。原则上， 某些补体成分也可能发生非特异性结合
。替代途径可耗尽两种途径共有的后期起作用的成分， 即
除C1、C4 和C3 以外的成分（1）。4在 B部分（第 12 节）
，通过经典途径介导的致敏红细胞溶解来测定血清在接触
测试材料后剩余的补体活性。
5.3 如本文所述， 体外全补体激活评估为预测拟用于人
体临床应用的医疗材料与血液接触时可能引发的补体激活
提供了一种方法。还有其他检测补体激活的方法可用， 包
括针对特定补体成分及其裂解产物的检测（见 X1.3 和
X1.4）.
5.4 本体外测试方法适用于在制定用于人体植入医疗器
械或与人体血液接触的医疗器械所用固体材料的规范和标
准时采用， 以对这些材料进行筛选。
6.缓冲液的配制
6.1 缓冲液应按照详细的操作规程（2）配制。“水 ”一
词在文中均指蒸馏水且不含内毒素。建议使用巴比妥（戊
巴比妥）缓冲液。 巴比妥属于受管制的 IV 类物质， 购买
时需持有美国缉毒局（DEA）（ 3）颁发的许可证。若能
证明其他缓冲系统（如 TRIS）不会激活补体（4），则也
可使用。
6.25 倍浓缩的巴比妥缓冲盐水（BBS） 的配制方法是： 向
约400 毫升水中加入 20.75 克氯化钠和 2.545 克钠巴比妥
（5,5-二乙基巴比妥酸钠）， 用 1摩尔/升盐酸将pH 值调
至7.35， 然后在容量瓶中定容至 500 毫升。
6.3 金属溶液的制备方法为：将 40.66 克六水合氯化镁
（MgCl囚·6H囚O） 溶于 100 毫升无热原蒸馏水中， 配制
成2.0 摩尔/升的溶液； 将 4.41 克二水合氯化钙（CaCl囚 ·
2H囚O）溶于 100 毫升无热原蒸馏水中， 配制成 0.3 摩尔/
升的溶液；然后将这两种溶液按 1:1（体积比）混合。这些
溶液在 4℃下可稳定保存一个月。
用 1N 氢氧化钠或 1N 盐酸将 pH 调至 7.65，然后在容
量瓶中定容至 200 毫升。
6. 7 BBS-G-EDTA（用于制备红细胞前的处理， 之后需冲
洗掉） ， 是通过在容量瓶中向 90 毫升 BBS-G 中加入 10
毫升10 倍浓缩的 EDTA 溶液来配制的。
7.绵羊红细胞的制备
7.1 商购的保存在阿尔塞弗溶液中的绵羊红细胞（RBC
）应在 4℃下保存。 细胞在八周后或第二次洗涤后的上
清液经肉眼观察含有血红蛋白时应予以丢弃。
注释 1—所有离心操作均在 4℃下进行。除非另有说明， 所有试剂
、试管和细胞制剂均置于冰上保存。
7.2 将5毫升绵羊红细胞以 1000×g离心 10 分钟。
7.3 将细胞沉淀在 10 毫升冷的 BBS-G-EDTA 中重悬， 于
37℃孵育 10 分钟。离心细胞， 然后将沉淀在 10 毫升
BBS- G-EDTA 中重悬。
7.4 将细胞离心， 弃去上清液（第一次洗涤），然后将
沉淀物悬浮于 10 毫升冷 BBS-GM 中。重复此操作两次
（总共洗涤三次）。
7.5 用分光光度法测定细胞数量（在 412 纳米波长、 1厘
米光程下， 1体积 BBS-GM 中的细胞加上 24体积水， 吸
光度为 0.56 时对应 1.5 ×10囚 个绵羊红细胞/毫升），或
者用血细胞计数板计数， 配制 10 毫升 1.5 ×10囚 个细胞/
毫升的冷BBS-GM 悬液。
7.6 洗涤并稀释后的红细胞可在冰上保存并至少使用 12
小时。
8.血清（补体） 的吸收
8.1 由于不同物种之间补体激活的效率存在差异， 且测
试材料将用于人体， 因此需要使用人源补体。人血清作
为补体的来源， 可从生物供应公司购买， 通常会标注为
试剂级补体。
8.2 为去除人血清中天然存在的抗绵羊红细胞溶血性抗体，
可将人血清与绵羊红细胞一起吸收，不过在大多数情况下，
6.4 BBS-GM 工作溶液每天配制， 将 0.25 克明胶溶于 50
毫升无内毒素的蒸馏水中， 水温需轻微加热并搅拌。将明
胶溶液加入 50 毫升 5倍浓缩的 BBS 溶液和 0.25 毫升金属
溶液中， 加水至约 200 毫升， 然后用 1N 盐酸或 1N 氢氧
化钠调至 pH值7.35， 最后在容量瓶中定容至 250 毫升。
6.5 BBS-G 工作溶液的配制方法相同，但省略了金属溶液的
添加。
6.610X 贮存用乙二胺四乙酸二钠（0.1 M 二水合乙二胺四
乙酸二钠）的配制方法是：向约 160 毫升水中加入 7.44 克
乙二胺四乙酸二钠二水合物，
4括号内的粗体数字指的是本规范末尾的参考文献列表.
人血清中的异嗜性抗体含量不足以影响反应， 前提是细
胞已用溶血素进行了最佳致敏处理。具体操作步骤见 8.3
至 8.8 节。
8.3 新鲜的人血清或市售的人血清一批被获取并储存在 -
70℃。新鲜血清更佳， 因为冻干的补体通常不如新鲜血
清活性强。
8.4 血清在冰上解冻或（如为冻干粉） 用冰冷（4℃) 的
无内毒素蒸馏水复溶。
8.5 所有操作均在冰上进行， 使用冰镇的试剂和细胞；离
心在 4℃、 1000×g的条件下进行。整个过程必须在低温
下进行， 以避免在此步骤中补体被激活。
3
8.6 将冷血清与冷的、包装好的、洗净的绵羊红细胞混合，每
2.5 毫升血清加入 0.1 毫升红细胞， 在冰上孵育 10 分钟，然
后在 4℃下以 1000×g离心 10 分钟。小心地将上清液转移到
冰上的新容器中。
8.7 重复执行 8.6 中的程序两次。
8.8 吸收的人血清应分装于 0.5 至1.0 毫升的小份（方便单次
实验使用），置于带冷盖的微量离心管中， 于 -70℃保存，直
至使用。小份血清应在冰上解冻， 解冻当天使用， 不可再次
冷冻。.
9.最佳溶血素浓度的确定
9.1 为节省昂贵的试剂并避免前带效应， 确定最佳溶血素浓度
是必要的。购入市售兔抗绵羊红细胞血清（溶血素），解冻
， 若为冻干粉则用无内毒素的蒸馏水复溶， 在 56℃下加热30
分钟以灭活兔补体， 分装成方便的体积， 于 -70℃保存备用
。
9.2 将13×100 毫米的一次性玻璃管 9支置于冰浴架中， 向每
支管中加入 0.1 毫升浓度为 1.5 ×10囚 个细胞/毫升的洗涤过
的绵羊红细胞。 若需对结果进行统计学评估， 则每种条件应
使用 3支重复管。 否则， 使用 2支重复管甚至单支稀释管也
足够。 一组 3支重复管中仅加入 0.1 毫升冷 BBS-GM（无红
细胞对照， 用于补体颜色）。
9.3 向含红细胞的试管中， 一组三个试管各加入 1.1 毫升冷蒸
馏水（总裂解对照）， 另一组各加入 0.1 毫升 BBS-GM （
无溶血素对照），其余各组分别加入 0.1 毫升 1:2 系列稀释的
溶血素（试验）。建议抗体稀释度为 1:400 至1:25600， 其中
1:400 的稀释度设置两组。无红细胞对照组再加入 0.1 毫升
BBS-GM。
9.4 每支试管通过轻轻摇晃快速混匀以使细胞重新悬浮， 将试
管架放入 37℃水浴中孵育 10 分钟， 然后放回冰浴。
9.5 两组 1:400 抗体中的一组加入 1.0 毫升冷 BBS-GM（无补
体对照）。 除总裂解对照组外， 其余各管均加入 0.5 毫升冷
BBS-GM， 再加入 0.5 毫升稀释 1:100 或1:200 的吸收人血清
（补体）。
注意 2：对于特定批次的人血清， 1:100 或1:200 的稀释度
应能提供足够的补体活性。 另外， 在不含溶血素（仅含补体
） 的对照中， 溶血百分率不应超过 10%。如果 1:100 稀释度
的补体溶血率超过 10%， 则使用 1:200 的稀释度。 如果不含
溶血素的对照仍超过 10%， 则需要测试另一批次的血清。
9.6 手动摇晃试管使细胞悬浮， 然后将试管架置于 37℃水浴中
孵育 1小时， 并间歇摇晃以保持细胞悬浮状态。
9.7 1 小时后 ， 将架子置于冰上。 然后将冷管在 4℃下以
1000×g离心 10 分钟， 将上清液倒入相应编号的 13×100 毫
米玻璃管中。
9.8 在412 纳米处测量上清液的吸光度。通过从每个测试管和
对照管的 412 纳米吸光度中减去无红细胞对照管的吸光度
（三个重复管的平均值），再除以总裂解对照管的吸光度（
三个重复管的平均值）， 然后乘以 100， 计算出每个管的裂
解百分比。
9.9 每种条件下的最终裂解率表示为每组三个重复实验的三
个裂解率值的平均值±标准差。
9.10 通过绘制溶血素浓度的倒数与特定溶血百分比的关系曲
线可得到滴定曲线。 用于后续试验中红细胞致敏的溶血素浓
度为滴定曲线上平台期浓度的两倍（最佳溶血素浓度）。每
天使用时， 溶血素均需从储备液中新鲜稀释。
10. 全补体滴定法确定最佳血清稀释度
10.1 若需要对结果进行统计学评估， 则每种条件应进行三次
测定， 每种条件使用三个 13×100 毫米的一次性玻璃试管。
否则， 两次测定或单次测定即可。 试管应提前编号。 测定条
件包括完全裂解、 无补体（无 C'）、含和不含溶血素的人血
清（HS） 的测试（血清稀释） 以及无红细胞（补体颜色对照
，使用最高血清浓度）。所有试剂、 试管和操作均应在冰上
进行， 试管置于冰水混合物中的试管架上。
10.2 除无红细胞管外， 向所有试管中加入洗涤红细胞（每管
0.1 毫升， 浓度为 1.5 ×10囚 个细胞/毫升） 。无红细胞管加
入0.1 毫升冷缓冲液。
10.3 总裂解管加入 1.1 毫升蒸馏水。 无 C' 和加溶血素的测试
管加入 0.1 毫升最佳溶血素（见 9.10），无红细胞管加入 0. 1
毫升冷 BBS-GM。所有试管均摇匀以使细胞重新悬浮， 置于
37℃水浴中孵育 10 分钟， 然后放回冰上。
注释3—另一种可行的方法是配制一批足够一周内所有试验使
用的溶血素致敏红细胞。 这些细胞的浓度为 5 × 10囚/毫升
， 并在 4℃下保存。每次使用前都要进行洗涤， 如果发生溶
血， 则重新制备致敏细胞。 这些致敏细胞可直接使用， 无
需向每个试管中添加溶血素， 从而简化了实验操作。 未致敏
的红细胞可用作非特异性溶解的对照。
10.4 对除完全裂解管之外的所有管， 加入冷 BBS-GM 的最
大体积为 1.0 毫升， 减去将要加入的稀释血清的体积（见
10. 5） ， 稀释血清的最大加入体积为 0.5 毫升。不含 C 的
管加入1.0 毫升 BBS-GM。
10.5 冷冻血清在冷 BBS-GM 中稀释至所需浓度（尽量减少
搅拌）。建议先以 1:50 至 1:300 的比例对 HS 进行初步测
试。将稀释后的血清以 0.5 毫升的体积加入每个测试管中。
每个试管的最终体积应以 BBS-GM 补足至 1.2 毫升。
10.6 然后， 这些管子按照 9.6 至9.9 节所述进行处理。
10.7 特定批次的人血清的最佳稀释度定义为在此稀释度下非
特异性溶解达到最小的稀释度lysis

标签： #ASTM #标准试验方法 #检测

摘要：

1本国际标准是依据世界贸易组织技术性贸易壁垒委员会发布的《关于制定国际标准、指南和建议的原则的决定》中确立的国际公认标准化原则制定的。Designation:F1984-25INTERNATIONAL用固体材料检测血清中完整补体激活的标准试验方法¹本标准以固定编号F1984发布；编号紧接在编号之后的数字表示最初采用的年份，如为修订版，则表示最近一次修订的年份。括号内的数字表示最近一次重新批准的年份。上标字母ε（e）表示自上次修订或重新批准以来仅做了编辑性修改.1.范围1.1本规程提供了一种快速的体外筛选方法，用于检测用于制造将与血液接触的医疗器械的固体材料的整体补体激活特性。1.2本规程旨在评...

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