ASTM E1262-24 中国仓鼠卵巢细胞次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因突变检测的性能（中文）
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1
该国际标准是根据世界贸易组织技术性贸易壁垒（TBT）委员会发布的《关于制定国际标准、指南和建议的原则的决定》所确立的国际公认标准化原则制定的。
编号：E1262-24
标准指南
中国仓鼠卵巢细胞/次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因突变检测的性
能¹
本标准以固定编号E1262发布；紧随编号后的数字表示原始采用年份，若为修订版本则表示最近一次修订年份。括号内数字表示最近一次
重新批准年份。
上标ε(e)表示自上次修订或重新批准以来的编辑变更。
1.范围
1.1
1²
本指南重点阐述当前主流生物学概念，并总结当前实
践中公认的生物测定关键指标。中国仓鼠卵巢细胞/次黄嘌
呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（CHO/ HGPRT）测定法（ ） 已
被广泛应用于工业与环境化学品的毒理学评估。该方法仅适
用于小规模遗传相互作用检测，因此在进行基因毒性评估
时，建议结合体外致染色体断裂试验（如染色体畸变、微核
试验）来检测大规模（如染色体）DNA损伤。
1.2 本指南重点阐述细胞培养、诱变操作流程、数据分
析、质量控制及检测策略等实践要点。所建议的操作方案
代表专家组对检测方法实施的共识意见。但需明确的是，
这些仅为通用指导原则，未经科学判断不得照搬。检测使
用者应根据待测物质特性及需解答的问题，对自身操作方
案进行评估。
1.3 基于合理科学判断的偏离指南行为，绝不应导致所获
结果无效。
1.4 以国际单位制（SI）表示的数值应视为标准值。本标
准未包含其他计量单位。
1.5
本标准不声称涵盖其使用过程中可能涉及的所有安
全问题（如有）。用户有责任在使用前建立适当的安全、
健康及环境实践，并确定监管限制的适用性。
！本指南由ASTM委员会F04（医用和外科材料与器械）管辖，且由生物
相容性测试方法分委会F04.16直接负责。
现行版本于2024年12月1日批准。发布于2024年12月。最初于1988年批
准。上一版本最后批准于2018年，编号为E1262-88（2018）。DOI:10.1520/
E1262-24。
2括号内加粗数字指代本指南末尾的参考文献列表
1.6
本 国 际 标 准 依 据 世 界 贸 易 组 织 技 术 性 贸 易 壁 垒
（
TBT
）委员会发布的《国际标准、指南和建议制定原则
决定》中确立的国际公认标准化原则制定。
2.意义与应用
2.1 CHO/ HGPRT 检 测 法 用 于 检 测 中 国 仓 鼠 卵 巢
（CHO）细胞中X连锁次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶
（hgprt）基因座（编码该酶 HGPRT）的正向突变。该细胞
最初来源于中国仓鼠卵巢组织，经受试物处理后，按照适当
的细胞培养方案，监测原始处理细胞群的后代是否因突变导
致功能性 HGPRT 缺失。以嘌呤类似物6-硫鸟嘌呤（6TG）
（或较不理想的8-氮杂鸟嘌呤（8AG））的耐药性作为遗传
标记。 HGPRT 催化无毒的6TG转化为其有毒的核糖磷酸化
衍生物。因此，酶的缺失或活性丧失会导致细胞对6TG产生
耐药性。
2.2
2-4
15
由于 HGPRT 是嘌呤核苷酸补救途径中的关键酶，其
缺失不会导致细胞死亡。该基因座可检测多种突变类型
（碱基替换、移码突变、缺失等）。该检测方法似乎无法
识别大规模染色体损伤。CHO/ HGPRT 检测技术已被广泛
应用于研究各类诱变剂，包括辐射（ ）、多种化学物质
（ ）以及复杂化学混合物（ ）。
3. CHO细胞的特性
3.1
7,8
CHO/ HGPRT 检 测 可 选 用 不 同 CHO 细 胞 系 或 亚 克
隆。由文献6开发并深入表征的CHO-K1-BH4细胞系可能是
应用最广泛的。除hgprt基因位点外，CHO（野生型）细胞
系及其衍生株CHO-AT3-2还可用于监测其他基因位点的突
变 。尽管所用细胞系存在差异，但检测性能的关键因素
包括若干通用特性：
3.1.1 母液培养物的克隆效率（CE）应不低于70%，未
处理或溶剂对照实验培养物的克隆效率（CE）应不低于
50%。
版权 OASTM 国际，100 律师 海港 驱动程序，PO 盒子 C700，西 康肖霍肯，宾夕法尼亚州 19428-2959. 联合国 国家
2
E1262-24
3.1.2 处于对数生长期的培养物应具有12至16小时的群体
倍增时间。
3.1.3 模式染色体数目应为20或21，这与所使用的特定细
胞系/亚克隆的特征相符。
3.1.4 培养物应无微生物及支原体污染。
3.2 作为质量控制方案的常规组成部分，应定期监测对检
测至关重要的细胞特性。常规质量控制程序应包括对每次
新采购的血清和培养基进行检测，以及每年至少一次（最
好每三个月一次）的支原体和核型检查。
4.诱变操作
4.1 该诱变方案可分为三个阶段：诱变处理、表达及筛选。
4.2
诱变剂处理：
4.2.1
⁶ ⁶
²
细胞铺板——进行细胞处理时，细胞应处于指数生
长期。可选用多种已知对细胞生长最有利的培养基（例如
Ham‘s F12，alpha-MEM）。细胞接种密度需适中，以确
保指数生长期并便于量化诱导反应。常规操作是：处理前
一天将0.5×10 个细胞接种于 25cm²flask ，或1.5×10 个细胞
接种于75 cm 培养瓶中。
4.2.2 化学处理——应在处理前测定受试物在适宜介质中
的溶解度。常用溶剂按优先顺序依次为：介质、水、二甲
基亚砜、乙醇。 丙酮。通常，非水溶剂浓度不应超过
1%，且所有样品的浓度应保持一致。作为溶解度测试的一
部分，应将测试化学品的等分试样加入处理介质中，以观
察任何pH变化、任何化学沉淀的存在，以及化学品或溶剂
与培养容器之间任何明显的反应。所选溶剂不应与受试
物、培养容器或细胞发生任何不良反应。
4.2.3
试验样品的细胞添加步骤——
先制备试验样品，再
分装至各培养瓶中。当未使用纯试样提取物时，需将试样
进行适当稀释，确保所有样本的溶剂浓度保持恒定。通常
需将细胞与试样共同孵育至少3小时。若处理时间为3至5小
时，可采用无血清培养基。由于维持细胞分裂需要血清，
长期处理（如16小时及以上）应使用含血清培养基。对于5
至16小时的处理周期，是否需要添加血清需根据具体情况
进行判断。
4.2.4
9,10
外源性激活系统——
Aroclor 1254诱导的大鼠肝匀
浆（S9）是该检测中最常用的外源性代谢激活系统。由于
Aroclor 1254的可获得性已大幅降低，其他标准大鼠肝S9诱
导剂（例如 β-萘黄酮与苯巴比妥组合）也常被使用。当使
用S9时，混合功能单加氧酶的辅因子必须存在。氯化钙
（CaCl₂） 作 为 能 增 强 亚 硝 胺 和 多 环 烃 致 突 变 性 的 物 质
（ ），似乎也是另一种有效的补充。
CaCl₂
CaCl₂
然而，对于多种化学物质而言， 的需求尚未得到充分
记录。一种常用的辅因子混合物由磷酸钠（50 mM，pH 7.0
至8.0）、 NADP（4 mM）、葡萄糖-6-磷酸（5 mM）、氯
化钾（30 mM）、氯化镁（10 mM）和 （10 mM）组
成。S9直接加入辅因子混合物中。将S9/辅因子混合物的1
体积加入4体积的处理介质中。根据实验目的，也可使用其
他外源系统（例如肝细胞、来自其他动物物种的S9或通过
不同酶诱导条件产生的S9，以及其他辅因子混合物）。
4.2.5
细胞毒性评估——直接接种处理后的
CHO
细胞
通常
能获得最准确的结果。若需延迟评估，可在处理次日进
行。需将细胞分装后接种以促进菌落形成。细胞毒性通常
以相对细胞效价（relative CE）表示，即处理组与溶剂对照
组的细胞效价比值。在评估细胞活力时，需考虑处理过程
中细胞损失、胰酶消化步骤及过夜孵育阶段的影响。
4.2.6
阳性对照与溶剂对照——合适的阴性对照
应采用与
受试物相同的溶剂处理细胞。为验证实验条件对已知诱变
剂的检测能力，需设置直接作用型与间接作用型两种阳性
对照。此外，可设置未处理对照以评估溶剂对诱变性的影
响。常用的阳性对照包括：作为直接作用型诱变剂的甲磺
酸 乙 酯 （EMS） 和 N- 甲 基 -N- 硝 基 -N- 亚 硝 基 胍
（MNNG）， 以 及 需 要 代 谢 活 化 的 促 诱 变 剂 苯 并 (a) 芘
（BaP）和二甲基亚硝胺（DMN）。
4.3
诱导突变的表达：
4.3.1
11,12
在hgprt基因座发生突变后，突变表型需要一段时间
才能完全表达（表达需要预先存在的酶活性丧失）。表型
表达可能是通过细胞分裂和大分子周转过程中预先存在的
HGPRT 酶和mRNA的稀释实现的。对于CHO细胞正常群体
倍增时间（12至16小时），7至9天的表达周期通常已足够
（）。
4.3.2
⁶
²
表型表达最常用的方法是让细胞在诱变剂处理后经
历一段特定时间的指数级生长。CHO细胞可使用含0.05%胰
蛋白酶的培养基进行传代培养，培养基中可添加或不添加
EDTA。将1×10 细胞分装后，每隔2或3天在直径100毫米的
组织培养皿或75厘米 t型培养瓶中进行传代培养。培养基可
选用完全培养基或无次黄嘌呤培养基，血清可采用透析或
未透析处理。关键是要确保所用培养基能让细胞群体倍增
时间控制在12至16小时之间。
4.3.3
8 13 14
除了作为单层培养的细胞正常生长外，涉及悬浮培
养（ ）、未贴壁培养（ ）和分裂阻滞培养（ ）的替代
传代方法也已取得成功。在表达阶段使用特定传代方案应
通过数据证实其能达到最佳表达效果。
4.4
突变体筛选：
E1262-24
3
4.4.1
11
15
为确保突变体细胞能够形成菌落且其集落形成能力
不受显著影响，必须明确筛选条件。通常将细胞接种于组
织培养皿进行贴壁集落生长（ ），或接种于琼脂培养基
进行悬浮集落生长（ ）。前者的优势在于固定染色后可
随时统计菌落数量；后者则能减少野生型与突变体细胞间
的代谢协作，从而提高单皿细胞密度。对于贴壁集落，一
般培养6至8天后，通过固定处理（如10%福尔马林或70%甲
醇）和染色处理（如10%吉姆萨染色或结晶紫染色）统计菌
落数量。软琼脂集落通常在培养10至14天后进行原位计
数。
4.4.2
⁵14,16
⁶
15
在不含次黄嘌呤的培养基中，通过添加透析血清
和10 μM 6TG可建立可靠的筛选体系。可选用胎牛血清、新
生牛血清或小牛血清，但需确保这些血清经过充分检测，
并能支持CHO细胞的优良特性（如本文所述）。通常需要
使用透析血清以消除血清中6TG与嘌呤碱基的竞争。研究发
现，当贴壁集落生长时，选择细胞密度为每100毫米培养皿
2×10 或更少细胞（ ）；当琼脂集落生长时，密度为每
100 毫 米 培 养 皿 10 或 更 少 细 胞 （ 在 30 毫 升 琼 脂 中 ）
（ ），可基本实现突变细胞100%的回收率。
5.数据展示
5.1 检测结果应包含以下实验数据：
6.1.2
⁶
在每次实验中，溶剂对照组的平均突变频率应控制
在每10 个可克隆细胞0至20个突变体的范围内。若突变频
率过高，则可能无法检测到弱诱变剂。在此情况下，需逐
个评估数据的可接受性。
6.1.3 阳性对照必须在所选实验条件下，以与诱变剂相匹
配的强度诱导出具有统计学显著性的反应。
6.1.4 如果可能，最高受试物浓度应能产生显著的细胞
毒性反应（例如，10%至30%的存活率，其中存活率是指处
理后仍存活的受试群体百分比）。若反应为阴性，这一点
尤为重要。对于非细胞毒性受试物，最高浓度通常为1至10
mg/mL，或达到溶解度极限。
7.数据分析
7.1 鉴于可能存在随机波动，数据分析仅应采用经处理
后存活细胞数不低于100000个的样本。致突变性判定应基
于以下信息：
7.1.1 剂量-反应关系
7.1.2 反应意义（与阴性对照相比）。
7.1.3 结果的可重复性
7.2 精确统计分析存在困难，因为突变菌落数量的分布取
决于诱变处理后细胞生长与死亡的复杂过程。虽然可采用
其他适当方法，但以下两种近似方法被广泛使用：
7.2.1
5.1.1 供试品与阳性对照品的浓度及溶剂
5.1.2 17
同步细胞毒性试验中的绝对克隆效率与相对克隆效
率（CE）。
5.1.2.1 绝对CE值——绝对CE等于形成的菌落数除以接种的细
胞数。
5.1.2.2 相对CE值——相对CE等于处理组CE值除以溶剂对照组
CE值。
5.1.3 各处理条件下观察到的突变菌落数量。
加权回归分析——一种加权回归
分析方法，其权重
与观察到的突变菌落数量除以观察到的突变频率平方成正比
（ ）。该加权方案的推导基于以下假设：观察到的突变频
率方差是泊松分布条件下各处理组选择平板上突变菌落数量
方差的固定倍数。根据t检验（18），若某测试化合物的突
变诱导率随测试浓度变化的斜率在0.01水平上大于零，则认
为该化合物具有致突变反应。
5.1.4 各处理条件选择时的绝对CE值。
7.2.2
5.1.5 ⁶
突变频率（MF）值，以每10 细胞中的突变体数量
表示。
功率转换程序——一种通过以下方程将观察到的
突变频率进行转换的功率转换
程序：
5.1.5.1
突变频率
突变菌株数量 F)
值——
MF
等于
除以数量
Y=(X+a)β (1)
可克隆细胞 在哪里
5.1.5.2
克隆细胞数量——可克隆细胞数量等于接种细胞
数乘以选择时的绝对
CE
值。
Y=转化突变频率，X=观察到的突变频
率，a，β=常数。
7.2.2.1
6.数据可接受性标准
6.1 18
一般而言，为使特定检测数据达到可接受标准，需满
足以下条件：
6.1.1 阴性对照的绝对培养效率（CE）不应低于50%。绝
对CE值低于50%表明细胞培养条件欠佳。
经该方法转换的数据似乎满足方差齐性与正态分
布的假设（ ）。通过Student t检 验和 方差 分析 （ANO-
VA）对转换后的数据与阴性对照值及剂量-反应关系进行比
较。相关计算可通过现成的计算机程序完成。
摘要：
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1该国际标准是根据世界贸易组织技术性贸易壁垒（TBT）委员会发布的《关于制定国际标准、指南和建议的原则的决定》所确立的国际公认标准化原则制定的。编号：E1262-24标准指南中国仓鼠卵巢细胞/次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因突变检测的性能¹本标准以固定编号E1262发布；紧随编号后的数字表示原始采用年份，若为修订版本则表示最近一次修订年份。括号内数字表示最近一次重新批准年份。上标ε(e)表示自上次修订或重新批准以来的编辑变更。1.范围1.11²本指南重点阐述当前主流生物学概念，并总结当前实践中公认的生物测定关键指标。中国仓鼠卵巢细胞/次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（CHO/HGPRT）测定法（）...
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2025-12-17 82
作者：冒牌货
分类：法规规范
价格：120质量币
属性：5 页
大小：926.26KB
格式：PDF
时间：2026-01-04
