美国药典 USP 2025〈87〉 体外生物学反应性试验

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状态：当前状态为正式生效，生效日期为2025年2月12日
生效日期：自2016年8月1日起生效
文件类型：通用章节
DocId：GUID-9B4F1BAD-38AE-44B2-AFE5- 89438725D580_1（英文版本）
DOI：https://doi.org/10.31003/ USPNF_M98833_01_01
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〈87〉 体外生物学反应性试验
以下测试旨在测定哺乳动物细胞培养物在接触弹性塑料及其他直接或间接接触患者的聚合物材料后，或接触由受试材料制备的特定
提取物后的生物学反应性。必须在规定的表面积上进行测试。当无法确定样本表面积时，每毫升提取液应使用0.1克弹性体或0.2克塑
料或其他材料。在材料制备过程中需谨慎操作，以防止微生物及其他异物污染。
〈
本文描述了三种测试方法（即琼脂扩散试验、直接接触试验和洗脱试验）。 选择何种测试类型或进行多少次测试以评估特定样品或提
取物的潜在生物反应，取决于材料本身、最终产品及其预期用途。其他可能影响样品适用于特定用途的因素还包括：聚合物组成；加工与
清洁工艺；接触介质；油墨；粘合剂；防腐剂的吸收性、吸附性及渗透性；以及储存条件。在确定由特定材料制成的产品适用于其预期用
途之前，应通过适当的补充性专项测试对这些因素进行评估。生物反应性测试，体内 〉中所述的体内试验适用于未通过体外试验的材
料。
程序
测试控制
阳性对照：含有二乙基二硫代氨基甲酸锌（ZDEC） 或二丁基二硫代氨基甲酸锌（ZDBC）的聚氨酯薄膜
细胞培养制备：在添加血清的最低必需培养基中，以约10 个细胞/毫升的接种密度，制备多个L-929（ATCC 细胞系 CCL 1，NCTC 克隆
929；也可使用从标准菌种库获取的其他细胞系，但需经过适当验证）哺乳动物成纤维细胞培养物。将培养物置于37±1°C、湿润的培养箱
中，在5±1%二氧化碳环境中培养至少24小时，直至形成融合度超过80%的单层细胞。通过显微镜检查培养物，确保其形成均匀且接近融合
的单层细胞。[注：体外生物学反应性测试的重复性取决于细胞培养密度的均匀性。]
提取溶剂：氯化钠注射液【参见专论——使用含0.9%氯化钠（氯化钠）的氯化钠注射液】。亦可采用无血清哺乳动物细胞培养基或含血清
的哺乳动物细胞培养基。当提取过程在37°C下进行24小时时，需添加血清。
装置
高压灭菌器：应使用能够维持121±2°C温度的高压灭菌器，该设备需配备温度计、压力表、排气阀、足以容纳测试容器于水面上方的支架，
以及水冷系统——该系统可在加热循环结束后立即将测试容器冷却至约20°C，但不得低于此温度。
烘箱：使用烘箱，优选机械对流式型号，其运行温度应维持在50°–70°范围内，偏差不超过±2°。培养箱：使用能够维持37±1°C温度及空气中
5±1%二氧化碳湿度的培养箱。
提取容器：仅使用I型玻璃制成的容器，例如安瓿瓶或螺旋盖培养试管及其等效容器。若使用培养试管或其等效容器，则需采用带有合适
弹性衬垫的螺旋盖进行密封。弹性衬垫的暴露表面需用厚度为50–75 µm 的惰性固体垫片完全保护。该垫片可采用聚酯薄膜制成。
设备准备：使用铬酸清洗液彻底清洁所有玻璃器皿；如有必要，可使用热硝酸清洗，随后用注射用无菌水长时间冲洗。采用适用于用于提
取、转移或给药的容器和器械的灭菌干燥方法进行灭菌处理。若使用环氧乙烷作为灭菌剂，则需静置48小时以确保完全脱气。
程序
〈
提取物样品的制备：按照 〉中所述方法进行制备。
〈提取物的制备：按照 〉中“提取物制备”部分的说明进行制备，可使用氯化钠注射液[0.9%氯化钠]。
（氯化钠）或无血清哺乳动物细胞培养基作为提取溶剂。[注——若在37°C的培养箱中进行24小时提取，应使用添加血清的细胞培养基。提取
条件在任何情况下均不应引起材料碎片的物理变化（如融合或熔化），仅允许轻微粘附。]
琼脂扩散试验
本测试适用于各种形状的弹性体密封件。琼脂层起到缓冲作用，可保护细胞免受机械损伤，同时允许可浸出化学物质从聚合物试样中扩散。待测材料的
提取物
OFFICIAL
2025年2月12日下午2:16 USP- NF 〈87〉体外生物反应性试验
待测试样本被施加于一张滤纸上。
样本制备：使用按说明制备的提取物，或使用测试样本中表面积不超过100 mm 的平坦表面部分。
阳性对照制备：按样本制备说明进行操作。
阴性对照样本制备：按样本制备说明进行操作。
操作步骤：按照《细胞培养制备》中的说明，使用7 mL细胞悬液在直径为60毫米的培养板中制备单层细胞。孵育完成后，吸除单层细胞上的
培养基，更换为含有 NMT 2%琼脂的补充血清培养基。[注：所用琼脂的质量必须足以支持细胞生长；琼脂层厚度需足够薄，以便浸出的化
学物质能够扩散。]将样本制备物、阳性对照制备物、阴性对照制备物或其提取物的平坦表面置于适当的提取介质中，以双重复培养形式与
固化的琼脂表面接触。每块培养板使用的样本数量不超过三个。所有培养物均在37±1°C条件下孵育至少24小时，建议使用含5±1%二氧化碳
的恒湿培养箱。如需要，可使用合适的染色剂在显微镜下观察每个样本、阴性对照和阳性对照周围的培养物。
结果解读：生物学反应性（细胞变性与畸形）需予以描述，并按0–4分量表进行评分（详见表1）。需测量细胞培养物对样本制备液、阳性对
照制备液及阴性对照制备液的反应。若观察到的阴性对照制备液反应等级为0级（无反应性），且阳性对照制备液反应等级至少为3级（中
度反应），则该细胞培养测试系统适用。若样本制备液引起的反应等级不超过2级（轻度反应），则样品符合测试要求。若系统适用性未获
确认，需重复上述操作流程。
表1. 琼脂扩散试验与直接接触试验的反应度分级
等级 反应性 反应区描述
没有一个 样本周围或下方未检测到任何区域。
轻微的 标本中存在一些形态异常或退化的细胞
轻度
区域仅限于样本下方区域，且超出样本范围的距离
小于0.45厘米。
中度 该区域比样本向外延伸0.45至1.0厘米。
严重的 该区域超出样本范围超过1.0厘米。
直接接触试验
本测试适用于各种形状的材料。该方法可使用添加血清的培养基同时提取并检测样品中的可浸出化学物质。该方法不适用于密度极低
或极高的材料，因为此类材料可能对细胞造成机械损伤。
样本制备：使用测试样本中表面面积NLT 100 mm 的平坦表面部分。
阳性对照制备：按样本制备说明进行操作。
阴性对照样本制备：按样本制备说明进行操作。
操作步骤：按照《细胞培养制备》中的说明，使用2 mL细胞悬液，在直径为35毫米的培养板中制备单层细胞。
直径。孵育完成后，吸出培养物中的培养基，并更换为0.8 mL新鲜培养基。在每个重复培养物中分别放置一份样本制备物、一份阳性对照
制备物和一份阴性对照制备物。将所有培养物置于含5±1%二氧化碳的湿润培养箱中，于37±1°C条件下继续孵育至少24小时。如需要，可
使用合适的染色剂在显微镜下观察每个样本制备物、阳性对照制备物及阴性对照制备物周围的培养物区域。
结果解读：按照琼脂扩散试验中的结果解读方法进行操作。该样本符合相关要求。
检测样本制备后的反应是否不超过2级（轻度反应）。若系统适用性未得到确认，则重复该操作流程。
洗脱测试
本测试旨在评估聚合物材料的提取物。该方法可在生理或非生理温度下，对样品进行不同时间间隔的提取。该方法适用于高密度材
料及剂量反应评估。
样品制备：按照“提取物制备”部分的说明进行操作，可使用氯化钠注射液[0.9%氯化钠（氯化钠）]或无血清哺乳动物细胞培养基作为提取
溶剂。若样品尺寸难以直接测量，可按每毫升提取介质加入0.1克NLT弹性材料或0.2克塑料/聚合物材料。亦可使用含血清的培养基。
OFFICIAL
2025年2月12日下午2:16 USP- NF 〈87〉体外生物反应性试验
采用补充了特定成分的哺乳动物细胞培养基作为提取介质，以更贴近生理条件进行模拟。提取物的制备方法是在含有5±1%二氧化碳的培
养箱中加热24小时。提取温度需维持在37±1°C，因为更高温度可能导致血清蛋白发生变性。
阳性对照制备：按样本制备说明进行操作。
阴性对照样本制备：按样本制备说明进行操作。
操作步骤：按照《细胞培养制备》中的说明，使用2 mL细胞悬液，在直径为35毫米的培养板中制备单层细胞。
直径。孵育完成后，从单层细胞中吸出培养基，并替换为样本制备液、阳性对照制备液或阴性对照制备液的提取物。添加血清与无血清的细
胞培养基提取物均需以100%原浓度进行双重复检测；而氯化钠注射液提取物则需用添加血清的细胞培养基稀释后，以25%提取物浓度进行
双重复检测。所有培养物均需在37±1°C、含5±1%二氧化碳的湿润培养箱中孵育48小时。培养48小时后，可根据需要使用适宜染色剂在显微
镜下观察各培养物。
结果解读：按照琼脂扩散试验的结果解读方法进行操作，但需使用表2。该样本符合要求。
若样品制备后的反应程度不超过2级（轻度反应），则需执行相应测试要求。若系统适用性未得到确认，则需重复该操作流程。对于剂量反
应评估，应使用样品提取物的定量稀释液重复该流程。
表2. 洗脱试验的反应性等级
等级 反应性 所有文化的条件
没有一个 离散的胞质内颗粒；无细胞裂解
轻微的
少于或等于20%的细胞呈圆形、附着松散
且无胞质内颗粒；可见少量裂解细胞。
轻度
超过20%至小于或等于50%的细胞呈圆
形且缺乏胞质内颗粒；未见广泛细胞裂
解及细胞间空隙区域。
中度
超过50%至不足70%的细胞层含有圆形
细胞或已发生裂解。
严重的 细胞层几乎完全损毁
附加要求
〈USP参考标准 〉USP高密度聚乙烯RS
（阴性对照）
更多详细信息参见美国材料与试验协会（American Society for Testing and Materials）的以下出版物：地址：宾夕法尼亚州费城 Race St.，1916。
19103：细胞毒性琼脂扩散细胞培养筛选的标准测试方法，ASTM编号 F 895-84；医疗器械材料直接接触细胞培养评估的标准实践，ASTM编号 F
813-83。
ZDEC 和ZDBC 聚氨酯产品可从日本神奈川县羽野市Ochiai 729-5号的Hatano研究所食品与药物安全中心获取。
辅助信息 -在联系USP之前，请在常见问题解答（FAQ）中查找您的问题。
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2025年2月12日下午2:16 USP- NF 〈87〉体外生物反应性试验

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