美国药典 USP 2025〈81〉 抗生素——微生物检测

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3.0 安心365 2026-04-30 2 2.06MB 24 页 80质量币
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状态：当前状态为正式生效，生效日期为2025年2月12日
生效日期：自2024年1月1日起生效
文件类型：通用章节
文档ID：GUID-05E7D599-06FC-451A-A82C-01014B49FA5E_5_en-US
DOI：https://doi.org/10.31003/ USPNF_M98820_05_01
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〈81〉 抗生素——微生物检测
引言及一般信息
抗生素的活性（效价）可通过其在适宜条件下对微生物的抑制作用予以证实。抗菌活性的降低可能无法通过化学方法充分证明。本章总结
了《美国药典》（USP）中认可的抗生素检测方法，其中微生物学检测是标准分析方法。
本研究采用两种通用技术：圆柱板（或平板）测定法和比浊法（或试管）测定法。表1列出了所有包含微生物测定的抗生素，并明确了测定类
型（圆柱板法或比浊法）。
表1
抗生素 检测类型
阿莫西林 圆柱板
两性霉素B圆柱板
杆菌肽 圆柱板
博来霉素 圆柱板
卡普雷霉素 浊度测定法
氯霉素 浊度测定法
氯四环素 浊度测定法
氯唑西林 圆柱板
科利茎和哈特 圆柱板
多粘菌素E圆柱板
双氢链霉素
圆柱板
浊度测定法
红霉素 圆柱板
庆大霉素 圆柱板
短杆菌肽 浊度测定法
萘夫西林 圆柱板
新霉素
圆柱板
浊度测定法
诺维比奥星 圆柱板
制霉菌素 圆柱板
土霉素 浊度测定法
OFFICIAL
2025年2月12日下午2:15 USP- NF 〈81〉抗生素——微生物检测方法
抗生素 检测类型
帕罗莫霉素 圆柱板
青霉素G圆柱板
多粘菌素B圆柱板
四环素 浊度测定法
硫链丝菌素 浊度测定法
泰乐菌素 浊度测定法
万古霉素 圆柱板
[注——所有操作均应在避免外源性微生物污染的条件下进行。由于可能存在药物过敏反应，且操作过程中使用了活微生物培养物，因此执行这些检测时须采
取充分的安全预防措施。]
圆柱板测定法
圆柱-平板测定法依赖于抗生素从垂直圆柱体通过培养皿或培养板中的固态琼脂层进行扩散。接种到琼脂中的特定微生物在含有抗生素
溶液的圆柱体周围的圆形区域（即“区带”）内无法生长。
浊度测定法
该比浊法检测原理基于：在有利于微生物生长的流体培养基中，抗生素均匀溶液会抑制微生物的生长；而在无抗生素存在时，微生物仍可正常生长。
单位与参考标准
〈
对于本章所述方法所测定的抗生素等物质——这些物质难以通过化学或物理手段进行表征——仍需以生物效价单位来表示其生物活性含
量，每个效价单位均由权威参考标准定义。抗生素的效价通常以单位(U)或活性微克（µg）表示。在所有情况下，抗生素活性的单位或活性微
克值最初均是参照该抗生素的美国联邦主标准确定的。这一做法的起源在于：最初选定作为参考标准的抗生素被认为完全由单一化学实体构
成，因此被赋予1000 µg/mg的效价值。在多个类似案例中，随着特定抗生素的制备和纯化技术日益先进，出现了活性超过1000 µg/mg的抗生
素。由于该数值是基于相对效价而非抗生素本身的质量来确定的，因此这类抗生素的“活性”相当于原始参考标准的特定微克数（而非预期的
1微克质量）。随着时间的推移，研究证实，结构较为简单的抗生素或仅含单一主要活性成分的抗生素，其活性微克值在数值上等同于纯物质
的微克（重量）。在这些情况下，抗生素的评估已不再依赖微生物检测方法，而是采用质量平衡法进行判定；在完成特定抗生素的质量平衡测
定之前，制造商不能假定其活性微克值与抗生素物质的微克（重量）完全对应。由于美国联邦抗生素主标准现已不再可用，对于本章所述方法
确定相对效价的美国药典（USP）抗生素参考标准，若存在世界卫生组织（WHO）抗生素国际标准（ISA），则按该标准进行校准；若不存在
WHO ISA或其他可与ISA校准的权威参考标准，则采用先前USP批次的标准进行校准。一旦确定效价，当使用国际单位（IU）时，需根据最初
确定相应参考标准时双方约定的桥接值，将其转换为USP单位。随着时间的推移，或许可以将更多抗生素的检测方法从微生物生物测定法转换
为物理化学方法，类似于《抗生素替代检测方法验证》微生物测定 〉中提出的方案，或其他包含经过验证的方法及相应桥接数据的合
适策略。
装置；设备
〈用于储存和转移测试稀释液及微生物的实验室器皿必须无菌且不含干扰性残留物（详见玻璃清洗设备 〉）。应采用经验证的灭
菌方法，如干热、蒸汽或辐射；或使用无菌的一次性实验室器皿。
温度控制
微生物检测的多个阶段均需采用恒温控制：包括微生物培养及接种物制备阶段，以及平板和试管检测中的孵育过程。具体各类检测的温度要求详见下
文。
测试生物体
每种抗生素的测试微生物在圆筒平板法检测中列于表3，在比浊法检测中列于表8。这些测试微生物均以美国典型培养物保藏中心（ATCC）编号
进行标识。
为确保测试微生物具有可接受的性能，需对其进行妥善储存与维护。在方法验证或确认过程中，应明确具体的储存条件。若观察到微生物特性发生改
变，则应弃用该培养物。
OFFICIAL
2025年2月12日下午2:15 USP- NF 〈81〉抗生素——微生物检测方法
长期储存
对于长期储存，应将测试微生物保存在适宜的储存溶液中，例如含50%胎牛血清的肉汤、含10%–15%甘油的胰蛋白酶大豆肉汤、去纤维蛋
白绵羊血或脱脂牛奶。长期储存的培养物最好以冻干状态保存；推荐温度为−60°C或更低；−20°C以下的温度也可接受。
原代培养物
将测试微生物从长期储存的试管中转移至适宜培养基上，制备原代培养物，并在适宜的生长条件下进行培养。原代培养物需储存于适
宜温度（通常为2°C–8°C），3周后弃用。单份原代培养物可用于制备工作培养物，其有效使用期限最长为7天。
职场文化
通过将原代培养物转移至适宜的固体培养基上，制备工作培养物以获得分离菌落。在适宜条件下培养工作培养物，以获得满足制备测试接
种物所需的良好生长条件。每个测试日均需制备新鲜的工作培养物。
测试生物体的非典型生长或性能表现
当测试微生物表现出非典型生长或性能时，应使用新的储备培养物、原代培养物或工作培养物。
检测方法设计
合理的实验设计是提高精确度和减少偏差的关键。对孵育参数（包括温度分布和时间）的控制对于最小化偏差至关重要；可通过按照各检测方法所
述的方式对培养板和培养架进行分阶段处理来实现这一目标。
圆柱板法测定
比较仅限于同一培养皿内各培养区直径测量值之间的关系，不包括不同培养皿之间的差异。每个培养皿的响应值均根据标准培养区相对
于所有培养皿中该标准培养区平均尺寸的相对大小进行标准化处理。
浊度测定法
为避免系统性偏差，应将重复试管随机放置在不同的试管架上，确保每个试管架包含一套完整的处理样本。这种布局设计旨在最大限度地
减少温度分布对重复样本的影响。由于试管架中样本的排列方式，比浊法检测对温度的微小变化较为敏感。通过确保孵育过程中有适当的气
流或热对流，也能降低温度变化的影响。每个样本及其标准浓度（一套完整的样本）至少应有3个试管置于同一试管架中。所有比较仅限于
同一试管架内观测到的浊度值之间的关系。
效价考量
在上述限制条件下，推荐的检测方案采用五浓度标准曲线，并使用每种样品制备物单一浓度。
若样品的计算效价值低于80%或高于125%，则该检测结果应被视为初步结果。此种情况下，结果表明样品储备液制备过程中所采用的样品
浓度存在偏差。此时可根据初步效价值调整样品的效价假设值，并重复检测。否则，效价值将基于标准品与样品响应曲线可能不平行的某段
区间得出。
微生物效价测定受批间及批内变量的影响；因此，需要进行三次或更多次独立检测才能可靠评估特定样本的效价。首先分别制备标准品和样
本的储备液及测试稀释液，对同一样本进行多次独立检测。平均效价应包含所有有效独立检测的结果。后者通过置信区间的宽度进行评估（参
见“置信限与检测组合计算”）。一系列较小规模、独立检测的综合结果，比使用相同总数量的培养板或试管进行单次大规模检测更能可靠地
反映效价。需注意，增加检测次数或降低检测变异性可使产品符合更严格的规格范围。通过减少检测变异性，可在更少的检测次数下达到所需
的置信限。
圆柱板法
温度控制
使用经过适当资质认证和校准的设备，以获得表3中规定的温度范围。
在圆柱板检测法中，每块板仅包含两种处理：参照处理（中位水平标准品，即 ）以及标准品的另外四种浓度之一（ 和 ）或样
品（ ）。样品浓度是基于目标浓度估算得出的。样品需稀释至其标称浓度估计等于标准品的中位参照浓度（ ）。稀释至中位参照浓度的
目的是确保样品结果落在标准曲线的线性范围内。该测试用于测定 相对于标准曲线的相对效价。样品（ ）的相对效价应约为100%。样
品的最终效价通过将 结果乘以稀释因子获得。
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2025年2月12日下午2:15 USP- NF 〈81〉抗生素——微生物检测方法

标签： #检测 #微生物 #USP

摘要：

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