基于分子生物学的医疗器械致病菌联合快速鉴定技术研究
VIP免费
)
5
(
56 Chinese Journal of Pharmaceuticals 2025,
· · 中国医药工业杂志
672
属、种及菌株水平确定的过程。ChP 2020 年版通则
1101、1106 和指导原则 9205 均规定应采用微生物鉴
定进行污染调查和溯源。此外，在生产中有时亦需
对原料、辅料、工艺用水和中间产品、终产品和环
境等中检出的微生物进行适当水平的鉴定。
在对非无菌医疗器械终产品进行微生物限度检
查时，金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、梭菌、白
基于分子生物学的医疗器械致病菌联合快速鉴定技术研究
李承芝，刘肖帅，马 恒，张小涵，张 静 *
( 山东省医疗器械和药品包装检验研究院，国家药品监督管理局医用卫生材料及生物防护器械质量评价重点实验室，
山东省医疗器械生物学评价重点实验室，山东济南 250101)
摘要 ：建立了快速鉴定非无菌医疗器械 4种致病菌 ( 金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白念珠菌、沙门菌 ) 的聚合酶链反
应(
PCR) 法，选用微生物限度实验室常见菌种互为试验组的对照菌，通过设计不同菌种的特异性序列引物，将 4种致病菌
的鉴定在一次试验中完成。通过评价特异性和最低检出限来确定该方法的适用性，并与飞行时间质谱方法及传统鉴定方法
进行比对。该方法可通过目的基因是否扩增及扩增产物的熔解温度值判定样本中是否含有上述 4种致病菌，为生产和检验
提供了一种致病菌的快速检验方法。
关键词 ：聚合酶链反应 ；快速检验 ；鉴定 ；微生物限度 ；致病菌 ；医疗器械
中图分类号 ：
R917 ；R197.39 文献标志码 ：
A 文章编号 ：
1001-8255(2025)05-0672-08
引用 ：李 承芝 , 刘肖帅 , 马 恒, 等．基于分子生物学的医疗器械致病菌联合快速鉴定技术研究 [J]．中国医药工业杂志 ,
2025, 56(5): 672-679．DOI ：10.16522/j.cnki.cjph.2025.05.015
Research on Rapid Identication of Pathogenic Bacteria on Medical Devices
Based on Molecular Biology
LI Chengzhi, LIU Xiaoshuai, MA Heng, ZHANG Xiaohan, ZHANG Jing*
(Shandong Key Lab. of Biological Evaluation for Medical Devices, NMPA Key Lab. for Quality Evaluation of Medical Materials and Biological
Protective Devices, Shandong Institute of Medical Device and Pharmaceutical Packaging Inspection, Jinan 250101)
ABSTRACT: A polymerase chain reaction(PCR) method was established for four pathogenic bacteria(Staphylococcus
aureus, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans, Salmonella) on non-sterile medical devices. Selecting common
bacterial strains in the microbial limit laboratory as control bacteria for each other, the identication of four pathogenic
bacteria was completed in one experiment by designing specic sequence primers for dierent strains. The applicability
of this method was determined by evaluating its specicity and minimum detection limit, and compared it with time-of-
ight mass spectrometry and traditional identication methods. This method can determine the presence of four pathogenic
bacteria in a sample based on whether the target gene has been amplied and the melting temperature value of the amplied
product, which provide a rapid detection method for pathogenic bacteria in production and testing.
Key Words: polymerase chain reaction; rapid detection; identication; microbial limit; pathogenic bacterium; medical
device
收稿日期： 2024-07-12
作者简介：
李承芝 (1990—)，女，硕士，从事微生物诊断试剂及医
疗器械微生物控制的研究。
通信作者： 张 静 ( 1984—)，女，副高级工程师，从事医疗器械质
量管理及微生物控制的研究与开发。
E-mail ：
pluto.kiki1@163.com
微生物鉴定是指通过对未知微生物的特征测
定，对其进行细菌、酵母菌和霉菌大类的区分，或
) · ·
5
(
56 Chinese Journal of Pharmaceuticals 2025,
中国医药工业杂志 673
念珠菌、大肠埃希菌、沙门菌等是常见的致病菌，
这些致病菌的鉴定方法在药典中没有明确规定。目
前主要通过观察检出菌的菌落形态、特有的生化反
应以及相关染色结果进行鉴定。这些试验需要准备
的试剂和耗材种类繁多，需要大量人力物力的支持。
近年来，基于分子生物学的聚合酶链式反应
(polymerase chain reaction，PCR) 技术在畜牧与动物
医学 [1—4]、食品检验 [5—6]、水产渔业 [7]、林业 [8]、
临床医学 [9—11]等行业中使用广泛，但目前在医疗器
械行业，尤其是在非无菌医疗器械的微生物限度检
查中的使用仍旧是空白。
本试验根据金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、
白念珠菌、沙门菌的保守序列设计 PCR 引物，通过
优化反应体系，建立了一种快速的微生物致病菌鉴
定方法，以期为生产和检验提供一种致病菌的快速
检验方法。
1 仪器与试药
LC480 Ⅱ型荧光定量 PCR 仪 ( 罗氏诊断有限公司 )；
VITEK MS Plus 型飞行时间质谱 ( 法国生物梅里埃公司 ) ；
MS1602TS 型电子天平 ( 瑞士 Mettler Toledo 公司 )。
表皮葡萄球菌(
ATCC12228)、金黄色葡萄球菌
(ATCC6538)、铜绿假单胞菌(
ATCC15442)、白念珠菌
(ATCC10231)、鼠伤寒沙门菌 (ATCC19430)、阪崎肠杆菌
(ATCC29544)、荧光假单胞菌 (ATCC17561)、大肠埃希菌
(ATCC8739) 均购自美国菌种保藏中心 ；乙型副伤寒沙门菌
[CMCC(B)20094，中国食品药品检定研究院 ]。
胰酪大豆胨琼脂培养基 (TSA，批号 L0779Y)、胰酪大
豆胨液体培养基 (TSB，批号 L0821Y)、沙氏葡萄糖琼脂培
养基 (SDA，批号 L0064Y)、甘露醇氯化钠琼脂培养基 ( 批
号为 L0811Y) 均购自广东环凯微生物科技有限公司 ；沙氏
葡萄糖液体培养基 (SDB，批号 9213074)、溴化十六烷基三
甲铵琼脂培养基 ( 批号 9010685) 均购自美国 BD 公 司 ；甘
露醇发酵培养基 ( 批号 180811)、念珠菌显色培养基 ( 批号
200713)、冻干血浆 ( 批号 200716)、绿脓杆菌生化鉴定盒 ( 批
号200721) 均购自北京陆桥技术股份有限公司 ；
N,N-二甲
基对苯二胺二盐酸盐 ( 南京化学试剂股份有限公司，含量≥
99％，批号 201113488Z)；
RV 沙门菌增菌液体培养基 ( 批
号1
806112)、三糖铁琼脂培养基 ( 批号 180629)、木糖赖氨
酸脱氧胆酸盐琼脂培养基 ( 批号 2102022) 均购自北京三药
科技开发公司 ；引物 ( 购自深圳华大基因股份有限公司 ) ；
SYBR® Green Realtime PCR Master Mix Plus 试剂盒 [ 东洋纺
( 上海 ) 生物技术有限公司 ]。
2 方法的建立
2.1 PCR 方法的建立
2.1.1 方法构建
增菌液制备 ：将菌种冻干粉按照说明书复溶后，
根据表 1所示将 4种致病菌接种至相应的培养基，
并在合适的温度下进行增菌培养。
表1 不同菌种的培养条件
Tab.1 Culture Conditions of the Pathogenic Bacteria
菌种 温度 /℃ 培养时间 /h 培养基 ( 增菌 ) 培养基 ( 单菌落 )
阪崎肠杆菌 32 24 TSB TSA
荧光假单胞菌 26 48 TSB TSA
鼠伤寒沙门菌 32 24 TSB TSA
表皮葡萄球菌 32 48 TSB TSA
金黄色葡萄球菌 32 24 TSB TSA
铜绿假单胞菌 32 24 TSB TSA
白念珠菌 24 48 SDB SDA
乙型副伤寒
沙门菌 32 24 TSB TSA
大肠埃希菌 32 24 TSB TSA
DNA 模板制备 ：取增菌液1 mL，涂布接种至
TBA/SDA 中，按表 1中的温度、时间进行培养，获
得不同菌株的单菌落。用接种环挑取单菌落至去离
子水中，振荡、混匀，作为模板使用。
引物序列及扩增程序 ：在 NCBI 数据库 (https://
www.ncbi.nlm.nih.gov) 中查找致病菌特有基因的保
守序列，通过 Primer-Blast 设计相关引物，引物序列
如表 2所示 ；引物经深圳华大基因股份有限公司合
成后按说明书中的比例加入去离子水，使用 SYBR®
Green Realtime PCR Master Mix Plus 试剂盒进行扩
增。经优化后，引物的使用浓度为 0.5 μmol/L，扩
增体系和扩增程序分别如表 3和表 4所示。
结果显示，经 PCR 扩增后，
oprI 基因可以使
铜绿假单胞菌扩增，熔解温度 (melting temperature，
Tm值)为84.91 ℃；
hilA 基因可以使沙门菌中的乙
型副伤寒沙门菌和鼠伤寒沙门菌出现扩增，Tm值分
别为 85.21 和85.22 ℃；
ebps 基因可以使金黄色葡萄
· · 中国医药工业杂志 Chinese Journal of Pharmaceuticals 2025, 56(5)
674
球菌出现扩增，Tm值为 81.27 ℃；
TS1-5.8s-TS2 基因
可以使白念珠菌出现扩增，Tm值为 83.80 ℃。扩增
曲线及熔解曲线如图 1所示。经多次试验确定的阳
性判定依据如表 5所示。
2.1.2 方法评价
2.1.2.1 特异性
在平板上挑取单菌落，加至纯化水 200 μL中作
为样本。对受试菌种进行扩增，除目标基因对应的
菌种为试验菌种以外，其他均为干扰菌种。分组详
情如表 6所示。照“2.1.1”项下方法进行扩增。
结果显示，经 PCR 扩增后，
oprI 基因仅在铜
绿假单胞菌中出现特异性扩增且 Tm值为 (
84.9±
0.05)℃ ；
hilA 基因仅在沙门菌中的乙型副伤寒沙
门菌和鼠伤寒沙门菌中出现特异性扩增且 Tm值为
(85.2±0.05)℃ ；
ebps 基因仅在金黄色葡萄球菌中出
现特异性扩增且 Tm值为 (81.3±0.05)℃ ；
TS1-5.8s-
表2 引物序列
Tab.2 Primer Sequences
菌种名称 基因名称 引物 引物序列 (5′→3′)
铜绿假单胞菌 oprI F GGGAGATTGCTGTTATGGAAATG
R GCTTCGGTTTCTTTGGAGTG
沙门菌 hilA F CAACCTACGACTCATACA
R GCGTAATTGATCCATGAG
金黄色葡萄球菌 ebps F CCACATGCCTCTAATAATG
R GCGATTTTATTTTCTTTTGTAC
白念珠菌 TS1-5.8s-TS2 F GAAAGACGGTAGTGGTAAGGC
R CTTAAGTTCAGCGGGTAGTCC
图1 致病菌的扩增曲线 (A)及熔解曲线 (B)
Fig.1 Amplication Curves(A) and Melting Curves(B) of the Pathogenic Bacteria
白念珠菌
金黄色葡萄球菌
乙型副伤寒沙门菌
鼠伤寒沙门菌
铜绿假单胞菌
循环数
0
荧光响应值
荧光响应值
24.196
20.196
16.196
12.196
8.196
4.196
0.196
A B
4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 75
11.489
9.489
7.489
5.489
3.489
1.489
0.489
80
T/℃
85 90
白念珠菌
金黄色葡萄球菌 鼠伤寒沙门菌
乙型副伤寒沙门菌
铜绿假单胞菌
表3 扩增体系的组成
Tab.3 Composion of the Reaction System
扩增体系 体积 /μL
SYBR®
Green Realtime PCR Master Mix-Plus 7.5
Plus Solution 1.5
引物 F 0.5
引物 R 0.5
样本 5.0
表4 扩增程序
Tab.4 Amplication Protocol
步骤 温度 /℃ 时间 循环数
预变性 95 10 min 1
变性
退火
延伸及检测荧光
95 10 s
4062 15 s
70 10 s
熔解曲线 45 30 s 1
95 保持 1
扩增
｛
表5 4种致病菌阳性的判定依据
Tab.5 Judgment Criterion of Positivity
of 4 Pathogenic Bacteria
致病菌 靶基因 是否扩增 Tm值/℃
铜绿假单胞菌 oprI 是84.90±0.05
沙门菌 hilA 是85.20±0.05
金黄色葡萄球菌 ebps 是81.30±0.05
白念珠菌 TS1-5.8s-TS2 是83.80±0.05
摘要：
展开>>
收起<<
)5(56ChineseJournalofPharmaceuticals2025,··中国医药工业杂志672属、种及菌株水平确定的过程。ChP2020年版通则1101、1106和指导原则9205均规定应采用微生物鉴定进行污染调查和溯源。此外，在生产中有时亦需对原料、辅料、工艺用水和中间产品、终产品和环境等中检出的微生物进行适当水平的鉴定。在对非无菌医疗器械终产品进行微生物限度检查时，金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、梭菌、白基于分子生物学的医疗器械致病菌联合快速鉴定技术研究李承芝，刘肖帅，马 恒，张小涵，张 静*(山东省医疗器械和药品包装检验研究院，国家药品监督管理局医用卫生材料及生物防护器械质量...
声明：如果您的权利被侵害，请联系我们的进行举报。
相关推荐
-
纯化水中国药典2020版与2025版GAP分析VIP免费
2025-04-18 412 -
无菌检查法对比表（2025版药典 VS 2020版药典）
2025-09-27 692 -
1101无菌检查法对比表（2025版药典 VS 2020版药典）
2025-09-29 625 -
1143 细菌内毒素检查法对比表（2025版药典 VS 2020版药典)
2025-09-29 999+ -
TR-26-2025-Sterilizing-Filtration-of-Liquids液体的灭菌过滤（中英文对照版）VIP专享
2025-11-06 565 -
TR-26-2025-Sterilizing-Filtration-of-Liquids液体的灭菌过滤（英文版）VIP免费
2025-11-06 196 -
PDA-TR49-生物清洁验证-中英文翻译
2025-11-19 231 -
硫酸艾玛昔替尼片（CXHS2300097）说明书VIP免费
2025-11-26 600 -
PDA TR60 Process Validation A Lifecycle Approach 2026VIP免费
2026-03-19 115 -
美国药典 USP 2025〈62〉非无菌产品的微生物学检测：特定微生物的检测方法VIP免费
2026-04-30 35
作者：大傻蛋
分类：实用文档
价格：50质量币
属性：8 页
大小：1.99MB
格式：PDF
时间：2026-06-29
