美国药典 USP 2025〈60〉细胞疗法生产中使用的生长因子与细胞因子

VIP免费
3.0 安心365 2026-04-30 0 944.19KB 5 页 80质量币
侵权投诉
状态：当前状态为正式生效，生效日期为2025年2月12日
官方日期：2013年之前的官方日期
文件类型：通用章节
DocId：GUID-1BE0B70D-4A3F-4239-968C- A8B7E7CD4A64_1（英文版本）
DOI：https://doi.org/10.31003/ USPNF_M3507_01_01
DOI参考编号：as7xc
请勿分发
引
〈92〉细胞疗法生产中使用的生长因子与细胞因子
言
试剂的资质认证、原料来源以及生产工艺的控制是确保细胞疗法质量与安全的关键要素。生长因子和细胞因子对于细胞疗法产品培养物
的维持、生长、筛选及纯化至关重要。本章阐述了细胞疗法产品生产过程中可能涉及的生长因子与细胞因子的公认检测方法、操作流程及
验收标准。
重组人白细胞介素4（rhIL-4）
〈
rhIL-4是一种由130个氨基酸残基组成的单链多肽，可在大肠杆菌中表达。该产品以冻干粉末形式生产，每毫克总蛋白含有NLT 0.5×10
USP单位的IL-4。IL-4中工艺特异性宿主细胞DNA杂质的限值低于1纳克/毫克，具体检测方法参见核酸技术 痕量核酸检测方法（残留DNA
检测） 〉。用于生产过程中作为辅助材料的IL-4无需生产许可证或市场批准。以下是IL-4的典型质量属性。
识别；鉴定
A. 使用自动化测序仪对至少八个氨基酸的氨基末端序列进行分析。通过在线反相高效液相色谱法，根据苯硫乙内酰脲氨基酸的洗脱时间对其
进行逐步释放后的鉴定。
B. 采用电泳法结合Western blotting分析技术对IL-4蛋白进行可视化检测。该方法为十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），具
体操作详见纯度检测部分。
磷酸盐缓冲盐水；Laemmli还原性样品缓冲液；以及Laemmli非还原性样品缓冲液：操作步骤参照《检测纯度》中的相应测试方法。
标准储备溶液：50 µg/mL 的复溶后的USP 人白细胞介素 4 RS，溶于磷酸盐缓冲盐水中。[注——混合时请勿剧烈搅拌；只需轻柔摇匀。]
标准溶液：取标准储备液中的IL-4，浓度为20 µg/mL，溶于磷酸盐缓冲盐水中。
标准溶液（还原条件）：将20 µL 标准溶液与5 µL Laemmli样品缓冲液混合，进行还原反应。
标准溶液（非还原型）：将20 µL 标准溶液与5 µL Laemmli样品缓冲液（非还原型）混合。
样品储备液：用磷酸盐缓冲盐水（PBS）重构的IL-4浓度为50 µg/mL。[注——混合过程中请勿剧烈搅拌；仅需轻柔涡旋。]
样品溶液：取样品储备液中的IL-4，浓度为20 µg/mL，溶于磷酸盐缓冲盐水中。
还原样品溶液：将20 µL 样品溶液与5 µL Laemmli样品缓冲液混合，进行还原处理。
样品溶液（非还原型）：取20 µL 样品溶液与5 µL Laemmli样品缓冲液（非还原型）混合。
分析
样品：还原性标准溶液；非还原性标准溶液；还原性样品溶液；非还原性样品溶液
Western blotting：电泳完成后，按照标准流程将蛋白质转印至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。将膜在室温下与含0.1% Tween 20和5%脱脂
奶粉的磷酸盐缓冲盐水共同孵育1小时。随后用抗IL-4抗体 （按适当比例用磷酸盐缓冲盐水稀释）对膜进行孵育，接着
OFFICIAL
2025年2月12日下午2:19 USP- NF 〈92〉细胞治疗生产中使用的生长因子与细胞因子
每种抗体均需在室温下、轻柔振荡条件下与二抗孵育1小时。通过使用合适的检测系统显影膜片，即可识别IL-4蛋白条带。
验收标准：所开发的Western blot检测方法应产生与 检测方法相当的阳性信号。
〈
纯度：[注——纯度以原料为基础测定。] SDS-PAGE 的操作方法详见生物技术衍生制品 聚丙烯酰胺凝胶电泳 〉中关于还原条
件与非还原条件下的描述。
分子量标记物：使用合适的分子量标记物，其蛋白质条带大小应在10至200 kDa之间。
Laemmli样品缓冲液（非还原型）：100 mM TRIS-HCl，pH 6.8,50%甘油，0.25%溴酚蓝指示剂，以及10%十二烷基硫酸钠水溶液
Laemmli样品缓冲液（还原型）：向50 µL Laemmli样品缓冲液（非还原型）中加入2.5 µL 巯基乙醇。
样品储备液：400 µg/mL 的批量制备 IL-4，溶于磷酸盐缓冲盐水中
样品溶液1：将20 µL 样品储备液与5 µL 非还原性Laemmli样品缓冲液混合。
样品溶液2：将20 µL 样品储备液与5 µL Laemmli样品缓冲液混合，进行浓缩。
对照A储备液：取样本储备液中的IL-4，浓度为4 µg/mL，溶于磷酸盐缓冲盐水中。[注——对照A溶液需在还原条件和非还原条件下各进
行三次重复实验。]
对照A溶液1：将20 µL 对照A储备液与5 µL 非还原性Laemmli样品缓冲液混合。
对照A溶液2：将20 µL 对照A储备液与5 µL Laemmli样品缓冲液混合，进行浓缩。
对照B储备液：含12 µg/mL IL-4（取自样本储备液），溶于磷酸盐缓冲盐水中。[注——对照B溶液需在还原条件和非还原条件下各进行两
次重复实验。]
对照B溶液1：将20 µL 对照B储备液与5 µL 非还原性Laemmli样品缓冲液混合。
对照B溶液2：将20 µL 对照B储备液与5 µL Laemmli样品缓冲液混合，进行浓缩。
电泳条件
〈
（参见生物技术衍生文章——聚丙烯酰胺凝胶电泳 〉。）
模式：不连续PAGE凝胶
堆叠凝胶：4%丙烯酰胺
分离凝胶：12%丙烯酰胺
运行条件：先在100 V下运行10分钟，随后在200 V下运行30分钟。
蛋白质检测：银染法
分析
样品：样品溶液1、样品溶液2、对照A溶液1、对照A溶液2、对照B溶液1和对照B溶液2。将每种样品溶液和对照溶液各25 µL 在非还原条件下
于60℃孵育5分钟，随后上样至凝胶。
将每份样品溶液和对照溶液各20 µL 置于还原条件下，于60°C孵育5分钟，随后上样至凝胶。完成银染及整个凝胶扫描后，通过光密度
测定法测定所有可检测蛋白条带的强度，并分别采用以下公式两次计算样品溶液中各可检测蛋白条带的百分比：将每个污染条带的像素
强度与对照溶液A和B的平均值进行比较。
对IL-4对照溶液的分析应产生一条可检测条带，其表观分子量约为15 kDa。若通过对照A溶液计算得出的数值与对照B溶液比对结果存
在差异，则应采用杂质含量最高的数值。若某污染条带的强度低于对照A溶液的数值（对应1%），则该污染值应设定为1%。随后即可
计算样品溶液的纯度：
结果 = 100 – Σ C
C = 各污染成分的百分比，以四舍五入后的整数表示
n = IL-4样品溶液中的污染物数量；验收标准：经SDS-PAGE测定，IL-4的纯度
不低于97%。
蛋白质含量：[注——蛋白质含量以包装产品为准。]
磷酸盐缓冲盐水：含2.67 mM氯化钾、1.47 mM磷酸钾（ ）、137.93 mM氯化钠及8.06 mM磷酸氢二钠的水溶液。调节pH至7.0–
7.3。
结果 = ( ) × 1/( )
结果 = ( ) × 3/( )
=样品溶液中一条污染条带的强度
=对照A溶液中所有可检测条带的平均强度
=对照组B溶液中所有可检测条带的平均强度
OFFICIAL
2025年2月12日下午2:19 USP- NF 〈92〉细胞治疗生产中使用的生长因子与细胞因子
磷酸盐缓冲盐水：按纯度检测方法中的指示进行操作。
样品溶液：50 µg/mL的IL-4，溶于磷酸盐缓冲盐水中。[注——混合过程中请勿剧烈搅拌；仅需轻柔摇匀。]
空白：磷酸盐缓冲盐水；光谱测定条
件
〈
（参见紫外-可见光谱法 〉。）
模式：UV
分析波长：280 nm 分析
样品：样品溶液与空白溶液
计算蛋白质浓度：
=样品溶液的IL-4浓度（mg/mL）= 280 nm处的吸光度
特定测试
生物活性：[注——生物活性测定基于包装后的产品进行。]
RPMI 含L-谷氨酰胺的1640培养基：按所示比例将各成分混合，并加入足量水配制成1升培养基，通过过滤进行灭菌：
材料 数量
100毫克
100毫克
氯化钾 400毫克
氯化钠 6000毫克
无水磷酸氢二钠 800毫克
碳酸氢钠 2000毫克
甘氨酸 10毫克
L-精氨酸 200毫克
L-天冬酰胺 50毫克
L-天冬氨酸 20毫克
L-聚偏氟乙烯L-胱氨酸二盐酸盐 20毫克
L-谷氨酸 20毫克
L-谷氨酰胺 300毫克
L-组氨酸 15毫克
L-羟脯氨酸 20毫克
L-异亮氨酸 50毫克
L-亮氨酸 50毫克
L-赖氨酸盐酸盐 40毫克
L-甲硫氨酸 15毫克
L-苯丙氨酸 15毫克
硝酸钙（Ca( O）
硫酸镁（ ）
OFFICIAL
2025年2月12日下午2:19 USP- NF 〈92〉细胞治疗生产中使用的生长因子与细胞因子

标签： #USP

摘要：

状态：当前状态为正式生效，生效日期为2025年2月12日官方日期：2013年之前的官方日期文件类型：通用章节DocId：GUID-1BE0B70D-4A3F-4239-968C-A8B7E7CD4A64_1（英文版本）DOI：https://doi.org/10.31003/USPNF_M3507_01_01DOI参考编号：as7xc©2025USPC请勿分发引〈92〉细胞疗法生产中使用的生长因子与细胞因子言试剂的资质认证、原料来源以及生产工艺的控制是确保细胞疗法质量与安全的关键要素。生长因子和细胞因子对于细胞疗法产品培养物的维持、生长、筛选及纯化至关重要。本章阐述了细胞疗法产品生产过程中可能...

展开>> 收起<<
美国药典 USP 2025〈60〉细胞疗法生产中使用的生长因子与细胞因子.pdf

共5页,预览5页

还剩页未读， 继续阅读

声明：如果您的权利被侵害，请联系我们的进行举报。

相关推荐

更多
立即下载
作者：安心365 分类：专业资料 价格：80质量币 属性：5 页 大小：944.19KB 格式：PDF 时间：2026-04-30

相关内容

更多

热门标签

医疗器械 管理 程序 报告 指南 验证 GB 器械 ISO 控制程序
/ 5
评分 收藏
分享
立即下载 VIP免费下载
客服
关注