美国药典 USP 2025〈56〉微生物对灭菌过程耐药性的测定方法

VIP免费

3.0 安心365 2026-04-30 1 879.73KB 4 页 80质量币

侵权投诉

状态：当前状态为正式生效，生效日期为2025年2月12日

生效日期：自2022年8月1日起生效

文件类型：通用章节

文档ID：GUID-9426A9DA-F9A0-4E48-A408-33406AC7353B_2_en-US

DOI：https://doi.org/10.31003/ USPNF_M13735_02_01

请勿分发

添加以下内容：

▲〈56〉微生物对灭菌过程耐药性的测定方法

引言

灭菌过程依赖于对被灭菌材料内部及表面存在的微生物进行可靠灭活。关于生物负载对灭菌过程耐受性的信息（除过度杀灭工艺外）对于确

认灭菌效果至关重要（参见《药典》条目灭菌〈1229〉），同时也是参数化放行计划的必要组成部分（）。芽孢对所有灭菌方式均具有固

有的、程度各异的耐受性。目前关于某些产芽孢微生物和致病微生物的耐药性数据较为有限；然而，对于绝大多数微生物（包括大多数芽

孢），尚无关于其在药品制品内部或表面存在时对灭菌过程敏感性的数据。此外，生产过程中获得的野生型微生物及其芽孢很可能与其参考

标准菌种库中的对应菌株存在差异，并可能表现出不同的灭菌耐受性水平（）。本章概述了可用于确定孢子存在情况以及微生物、孢子和生

物指示剂（BIs）对湿热灭菌耐受性的方法，包括〈1229.2〉和of

〈1229.3〉中提及的煮沸试验的各种变体。本章所述方法不适用于辐射灭菌，后者需遵循ISO 1 1 137 中规定的程序）。

一般程序

应在专门设计的条件下进行测试，以避免待检材料受到外源性微生物污染。所采取的防污染措施必须确保不会影响测试中检出的微生物。

若待检产品具有抗菌活性，则应在孢子存在与否的测试过程中尽可能将其去除或中和。若使用灭活剂实现此目的，则必须证明其有效性及对

微生物的无毒性。若采用表面活性物质进行样本制备，则必须证明其对微生物的无毒性以及与所用灭活剂的相容性。

样品的制备

样品制备方法取决于待测预灭菌材料的物理特性。对于水性产品，应从密封的一级容器中抽取10 mL样品；也可采用复合取样法。对于固

体、水不溶性或不混溶性产品，请遵循微生物计数试验〈61〉中提供的样品制备细节。样品需无菌转移（可取自1个单位产品或复合样品）

至无菌螺旋盖试管中。为最小化变异度，至少应检测10份样品。

孢子存在/缺失检测（除过滤和辐射灭菌工艺外的所有灭菌流程）

在过度杀灭灭菌工艺中，一个普遍假设是：与生物负载（BI）相比，生物负载微生物的耐受性可忽略不计，因为BI被特意选作灭菌过程的

“最恶劣条件”。这一假设的前提是灭菌前生物负载中不存在孢子。可通过将生物负载样本置于70°–75°C环境中30分钟进行测试，以确认孢

子的缺失。营养型微生物很少对>70°C的温度具有耐受性，此类条件下会被灭活。然而，在存在非营养性萌发剂（如Ca- DPA 和十二胺——这

些物质并非微生物生长所必需，但能促进孢子萌发）的相同温度条件下，热激活会促进孢子萌发。该测试适用于灭菌前生物负载中孢子存活概

率较高的情况。当检测到孢子时，应按照下述湿热灭菌方法或ISO 1 1 138 系列标准进行耐药性测试，以确认灭菌效果充分。

热处理

将螺旋盖试管置于水浴中，将内容物加热至70°–75°C，并在此温度下保持30分钟。

孢子的回收与计数

立即将产品冷却至30°–35°，无菌条件下加入无菌二吡啶甲酸钙（Ca- DPA）和十二胺（非营养萌发剂），溶液使用pH 7.0的缓冲氯化钠-蛋白胨溶液或pH

7.2的磷酸盐缓冲溶液配制，分别获得60 mM和1.2 mM的浓度。将溶液在30°–35°下保持30分钟。根据〈61〉采用膜过滤法或平板计数法进行检测。

OFFICIAL

2025年2月12日下午2:10 USP- NF 〈56〉微生物对灭菌过程耐受性的测定方法

使用含有60 mM Ca- DPA 和1.2 mM十二烷基胺的大豆-酪蛋白消化琼脂培养孢子，于30–35°C条件下培养5–7天，以促进其复苏与生长。

阳性对照与阴性对照

为验证热处理的有效性，需设置阳性对照：向至少一个额外测试样本接种可计数数量的孢子（如枯草芽孢杆菌），必须观察到微生物

生长。为验证测试条件，需设置阴性对照：使用选定的稀释液置于螺旋盖试管中替代测试样本，必须确保无微生物生长。

培养基的促生长作用

每批含60 mM Ca- DPA 和1.2 mM十二胺的大豆-酪蛋白消化琼脂均需进行测试，具体方法参见微生物计数试验〈61〉及表1。

恢复与枚举的适用性

按照〈61〉所述方法进行适用性验证：向冷却后的产物中加入足量的枯草芽孢杆菌 ATCC 6633、NCIMB 8054、CIP52.62或NBRC 3134

微生物悬液，并在含有60 mM CaDPA和1.2 mM十二胺的大豆-酪蛋白消化琼脂上显示可接受的回收率。

结果解读

菌落形成单位的存在表明孢子存在于产品表面或内部，因此应考虑对其耐药性进行更明确的评估（详见下文）。

电阻估算（仅适用于湿热工艺）

该测试方法亦称为煮沸试验，可用于评估预灭菌产品中孢子的湿热耐受性。首先，可通过设定不同时间间隔来估算湿热耐受性（初步耐受

性评估）；也可采用符合既定耐受性限值的单一时间区间（最大耐受性评估），以支持参数放行流程，从而确认灭菌工艺的适用性。上述任

一测试均可与生物指示微生物的平行检测同步进行，以便进行对比分析。

初步阻力估算

将样本转移至螺旋盖试管中置于水浴中，将内容物加热至95°–100°，并在该温度下进行不同时间的孵育（参见表1）。孢子的回收与计数、

阳性与阴性对照、培养基的生长促进作用以及回收与计数方法的适用性均按上述方法进行。

结果解读

孢子的估算湿热耐受性通过菌落生长达到最大值的时间确定，具体数据见表。

1. 可通过调整95°至100°条件下的停留时间（缩短或延长），以适应所检测微生物的特性。

最大电阻估算

将样品转移至螺旋盖试管中置于水浴中，将内容物加热至95°–100°C，并在此温度下孵育指定时间。孢子的回收与计数、阳性与阴性对

照、培养基的生长促进作用以及回收与计数方法的适用性均按上述方法进行。

结果解读

菌落形成单位的存在表明，这些孢子具有一定程度的湿热抗性，能够抵抗灭菌处理，这一现象需要进一步研究。

表1. 通过煮沸试验估算的耐湿热性

95°–100°下的暴露时间

实现正增长

(分) (分)

D值测定（仅适用于湿热工艺）

近似值

OFFICIAL

2025年2月12日下午2:10 USP- NF 〈56〉微生物对灭菌过程耐受性的测定方法

测定微生物和生物指示剂（BI）的D值是灭菌周期开发与验证的必要环节。现行测定方法主要针对约121°C的湿热灭菌工艺，且依赖专

门设计用于饱和蒸汽环境运行的设备。对于低温湿热灭菌工艺中获得的生物指示剂和生物负载分离株，采用下文所述的替代方法可更准确地

测定其耐受值。

>110°工艺的D值测定

〈 〉

应遵循《生物指示剂——耐药性性能试验》中所述的方法。有关操作程序和设备的更多详细信息，可参阅ISO 18472《医疗保健产

品的灭菌——生物和化学指示剂——试验设备》（）。

≤110°工艺的D值测定

用于在121°C下测定D值的装置采用饱和蒸汽，其设计和操作原理与蒸汽灭菌器相似。由于灭菌过程温度≤110°C，因此有必要对测试设备

和方法进行调整，以更好地适应较低温度条件。为适应被测微生物（）的特性，可能需要调整停留时间（缩短或延长）和操作温度。这些

方法直接适用于用于低温湿热处理的生物指示剂（BI），并需针对生物负载分离株进行相应调整。

程序

在与预期使用条件一致的灭菌条件下进行D值测试。使用20份重复测试样本（BI或生物负荷分离株），将其置于NLT 5暴露条件下进行总计

100次测试。选择的暴露条件数量应能覆盖从低于预期存活时间的NLT 1 D值到高于预期灭菌时间的NLT 1 D值之间的观测范围。将每组样本

置于独立的合适样品容器中，使各样本能在95°–100°水浴中暴露于规定的温度条件（必要时可采用其他温度）。使用含模拟测试样本的样品

容器检查设备运行参数。按递增步长选择一系列灭菌时间，起始时间应为待测样本所需的最短灭菌时间。该系列灭菌时间间的差异应尽可能

保持恒定，相邻时间点间的差异 NMT 预期D值的75%。微生物耐药性评估的测试程序详见ISO 11138系列标准（）。所采用的检测方法及

载体可根据被评估微生物的具体特性进行调整。

对于以悬浮孢子形式存在的微生物，该检测采用适当的系列稀释法进行，稀释比例基于悬浮液在无菌试管中的灭菌纯化水中所规定的

孢子滴度。

恢复；康复

〈 〉

灭菌程序完成后，在规定时间内（NMT 4小时），需无菌操作将每个样本移出并加入适宜培养基（参见无菌检测中的培养基与培养

温度），并将样本完全浸入专用试管中。对于自封闭式生物指示剂（BIs），应按照制造商说明，在 NMT 4小时的时间内将试纸条浸入自

封闭培养基中。对于接种了孢子悬液的不溶性样本，需无菌操作将每个样本单独转移至适宜培养基（详见中的培养基配方，该配方需

补充60 mM Ca- DPA 和1.2 mM十二烷基胺），并将样本完全浸入培养基中。完成密封水容器的接种后，按所述方法对各样本进行单

独检测。

将每支试管置于最佳回收温度下培养。对于生物负荷分离株，可根据需要调整回收方法及培养基。接种后需在相应时间点对每支含培养

基的试管进行观察，总观察期为7天。若在任何观察时间点均观察到菌落生长，则可省略对该受试样本的进一步培养。记录在任何时间点

均未出现生长迹象的样本数量。

当使用产芽孢梭菌（Clostridium sporogenes）或其他厌氧微生物作为生物指示剂（BI）时，其制备、接种、回收及培养基的方法必须

相应调整，以适应这些厌氧产芽孢微生物的应用需求。

计算

微生物D值的测定可采用有限Spearman-Karber法、存活曲线法或Stumbo-Murphy-Cochran法（）。当购买了生物指示剂（BI）

时，应使用其制造商规定的相同方法进行D值测定。采用其他方法可能导致结果差异，这种差异可能是方法本身造成的假象，而非生物指示剂

性能的差异所致。

参考文献

1〈 〉美国药典（USP）。药典制剂的灭菌。载于：USP–NF 。马里兰州罗克维尔：美国药典协会；2019年

5月1日。。

2. 〈 〉

USP。终灭菌药品——参数放行。载于：USP–NF 。马里兰州罗克维尔；2019年5月1日。source=Search%20Results&amp；high-

light=1222。

3. Pflug IJ. 《微生物学与灭菌过程工程导论课程大纲》。第4版。明尼苏达州圣保罗：环境灭菌服务公司；1980年。

4. 国际标准化组织。医疗保健产品灭菌——辐射（ISO 11137）。瑞士日内瓦：ISO；2013。

5. 〈 〉USP。生物负载监测。载于：USP–NF 。马里兰州罗克维尔：USP；2019年5月1日。

OFFICIAL

2025年2月12日下午2:10 USP- NF 〈56〉微生物对灭菌过程耐受性的测定方法

文档加载中……请稍候！
如果长时间未打开，您也可以点击刷新试试。

下载文档到电脑，查找使用更方便

立即下载 VIP免费下载

标签： #灭菌过程 #微生物 #USP

摘要：

状态：当前状态为正式生效，生效日期为2025年2月12日生效日期：自2022年8月1日起生效文件类型：通用章节文档ID：GUID-9426A9DA-F9A0-4E48-A408-33406AC7353B_2_en-USDOI：https://doi.org/10.31003/USPNF_M13735_02_01DOIRef:kr30s©2025USPC请勿分发添加以下内容：▲〈56〉微生物对灭菌过程耐药性的测定方法引言1,233MoistHeatSterilizationofAqueousLiquidsMonitoringBioburden4灭菌过程依赖于对被灭菌材料内部及表面存在的微生物进行...

展开>> 收起<<

美国药典 USP 2025〈56〉微生物对灭菌过程耐药性的测定方法.pdf

共4页,预览4页

还剩页未读，继续阅读

声明：如果您的权利被侵害，请联系我们的进行举报。

美国药典 USP 2025〈56〉微生物对灭菌过程耐药性的测定方法

相关推荐

相关内容

热门标签

举报选择: