美国药典 USP 2025〈55〉生物学指标——耐药性性能测试

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状态：当前状态为正式生效，生效日期为2025年2月12日

生效日期：自2019年11月1日起生效

文件类型：通用章节

文档ID：GUID-6C2992F1-FF4E-4CE3-88C9-6C94C6449C80_2_en-US

DOI：https://doi.org/10.31003/ USPNF_M98795_02_01

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〈55〉生物学指标——耐药性性能测试

引言

〈

生物指示剂（BI）是一种经过充分表征的特定微生物制剂，其对特定灭菌工艺具有已知的耐受性。在灭菌工艺的开发、验证和控制过程中，

正确使用BI需要准确掌握其菌群数量和耐受性特征。通过选择合适的菌群数量和耐受性参数，可验证特定灭菌工艺条件对产品是否充分。为有

效使用BI，应遵循《药典品项灭菌》〉中的建议。下文所述方法可用于确定菌群数量和耐受性参数，从而确保BI对目标灭菌工艺的响应

符合要求。尽管BI制造商必须按照下文规定的重复次数对菌群数量和耐受性进行严格控制，但最终用户在验证这些测定结果时无需采用相同的

重复次数。在适当的微生物学实验室条件下进行本章所述的所有测试（参见微生物学最佳实验室操作规范〉）。

存活孢子总数

样本采集/回收

纸张/纤维指示器

对于纸/纤维载体BI，从各自的容器中取出至少四个测试样品。将测试样品置于含有100 mL经灭菌且冷却至2°–8°的纯化水的无菌容器中，

将指示剂分散到组分纤维中，并通过机械破碎获得均质悬浮液。对于独立式BI，无菌条件下从容器中取出四个BI载体，按上述方法操作。

其他底物上的指示剂

对于所有其他生物指示剂，从各自的容器中取出至少四个样本。将测试样本置于含有100毫升经灭菌处理且冷却至2°–8°的纯化水的无菌容

器中，通过机械破碎使孢子在水中形成均匀悬浮液。

孢子悬浮液

对于BI的孢子悬液，应在无菌容器中，使用冷却至2°–8°的纯化水对原始孢子悬液进行适当的系列稀释，并按照下文规定的活孢子计数方

法进行操作。若活孢子平均数量在标示孢子悬液计数值的50%–300%范围内，则符合测试要求。

存活孢子数量

将10 mL悬液等分转移至无菌试管中。对于使用嗜热地芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus）、凝结芽孢杆菌（Bacillus coagula-

ns）及其他嗜热产芽孢菌种的生物指示剂（BI），需将含悬液的试管置于95°–100°水浴中加热15分钟（热休克处理），计时从温度达到95°时

开始。对于含非嗜热产芽孢菌种的BI，将试管置于80°–85°水浴中加热10分钟，计时从芽孢悬液温度达到80°时开始。随后将悬液快速置于0°–

4°冰水浴中冷却。取两份1 mL悬液分别转移至适宜试管中，并用灭菌的纯化水进行相应系列稀释。按下述方法操作时，需计算稀释度以确保

每对培养板上形成30–300个菌落。若BI的芽孢浓度较低，则可能需要调整稀释系列并在每个稀释梯度下使用更多培养板。

为每个等分样本单独准备一组培养皿。将每种选定稀释液各1.0 mL分别置于两个15×100毫米的培养皿中。20分钟内，向每个培养皿加入20

mL已融化并冷却至约45°C的大豆-酪蛋白消化琼脂培养基。搅拌至形成均匀悬浮液后静置使其凝固。将培养皿倒置置于55–60°C环境中培养

（适用于嗜热产孢菌），或置于30–35°C环境培养（适用于非嗜热产孢菌），或按照制造商指定的最佳回收温度进行培养。至少培养48小时

后观察培养皿，记录每个培养皿的菌落数。根据结果并结合相应的稀释倍数，计算每个测试样本的平均孢子数。在评估供应商提供的生物指

示剂（BI）时，活孢子计数应介于制造商标称值的50%至300%之间。

修改为：

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2025年2月12日下午2:09 USP- NF 〈55〉生物指示剂——耐药性性能测试

D值测定

装置

用于测定微生物耐药性（“D值”）的测试设备在ISO 18472《医疗保健产品灭菌——生物和化学指示剂——测试设备》（）中已有详尽

描述。各生物指示剂评估耐药仪（BIER）的具体参数因其设计特点及所适用的灭菌工艺而异。只要BIER容器的性能符合ISO标准对生物指示

剂暴露的要求，设计上的差异是可接受的。对于尚未明确适用BIER的单相灭菌工艺，可通过采用适用于相同灭菌阶段工艺的BIER设计来完

成D值测定。目前尚无适用于多相灭菌工艺的D值测定方法。

程序；流程

在与预期使用条件一致的灭菌条件下进行D值测试。使用20份重复测试样品（BI），将其置于原始独立容器中，经历至少五种暴露条件，共

计完成100次测试。选择的暴露条件数量应能提供从低于预期存活时间一个标定D值的非线性毒性试验（NLT）值，到高于预期杀灭时间一个

标定D值的NLT值之间的完整观测范围。将每组样品置于独立的合适样品架上，确保每个样品能在BIER灭菌舱内的指定位置接受规定的灭菌条

件。使用不含测试样品的样品架检查BIER设备的操作参数。按递增步长选择一系列灭菌时间，起始时间应为待测样品所需的最短灭菌时间。

该系列灭菌时间间隔应尽可能保持恒定，相邻时间间隔的差异应 NMT 预期D值的75%。关于使用BIER容器评估微生物耐药性的测试程序，已

在ISO 11138系列标准（）中明确规定。应遵循适用于生物指示剂（BI）的相应标准。用于BIER的测试方法及载体可根据BI的具体特性进

行调整。用于纸基载体的方法和设备可能与其他载体不同，且与用于BI悬浮液的方法和设备存在显著差异。

替代材料载体的D值暴露条件与用于确定纸载体D值的条件相同。若制造商标签允许BI载体采用多种灭菌方法，则制造商需为每种灭菌方法

提供D值、存活时间及杀灭时间的相关数据。

▲

对于孢子悬浮液形式的生物杀灭剂（BI），需针对以液体孢子培养液悬浮液形式提供的每种微生物进行D值测定。该测试采用基于悬浮液

在纯化水中规定的孢子滴度▲（ERR 1-2019年11月-）的适当系列稀释法，在无菌试管中进行。当悬浮液被置于或涂覆于弹性密封件或配

方产品等基材上时，其耐受性可能与在纯化水中测定的结果有所不同。这种差异对于生物杀灭剂的使用以及在灭菌验证活动使用前进行适

当测量具有重要意义。

恢复；康复

〈

在完成BI的灭菌程序后，并在规定时间内（NMT 4小时），无菌操作下将每个BI移入合适的培养基中（详见无菌测试〉），使BI完全

浸没于合适的试管内。对于自含式BI，需按照制造商说明，在规定时间 NMT 4小时内将纸条浸入自含式培养基中。对于接种了孢子悬液的

不溶性物品，需无菌操作将其逐一转移至合适的培养基中（详见〉），使物品完全浸没于培养基内。当密封的装有液体的容器完成接种

后，按〉所述方法对各单元进行单独测试。

将每支试管置于适用于该生物指示剂（BI）的最佳恢复温度下培养。接种后，在相应的时间间隔内连续观察每支含培养基的试管，总观察期

为7天。若在任一观察时间点均观察到菌落生长，则可省略对该受试样本的进一步培养。记录所有时间点均未出现生长迹象的样本数量。

当使用产芽孢梭菌（Clostridium sporogenes）或其他厌氧微生物作为生物指示剂（BI）时，其制备、接种及回收方法及培养基均需相

应调整，以适应这些厌氧产芽孢微生物的应用需求。

计算

BI的D值测定可采用有限Spearman-Karber法、生存曲线法或Stumbo-Murphy-Cochran法（）进行。若BI已购入，则应使用BI制造商

规定的相同方法来后续测定D值。采用替代方法所得结果的差异更多是方法本身所致的人为误差，而非BI性能的差异。

存活时间与死亡时间

取两组生物指示剂（BI），每组包含10个测试样本，均置于各自的原始独立容器中。将各组样本放入合适的样本支架中，使每个样本能够在BIER灭

菌舱内的特定位置接受灭菌处理。

将样本置于所需存活时间条件下，放入反应舱内，并取出装有10个测试样本的支架。立即重复上述步骤；若已过去较长时间，则需预先加

热，使第二个装有10个测试样本的支架处于与第一个相同的条件，但需达到规定的灭活时间。按上述方法回收生物指示剂（BI）。存活时间和

灭活时间应由BI制造商提供，并由最终用户进行验证。

OFFICIAL

2025年2月12日下午2:09 USP- NF 〈55〉生物指示剂——耐药性性能测试

参考文献

1美国国家标准协会（ANSI）/医疗器械促进协会（AAMI）/国际标准化组织（ISO）18472:2006。《医疗保健产品灭菌——生物学与化

学指标——测试设备》。第1版。弗吉尼亚州阿灵顿： AAMI 。

2. ANSI/ AAMI /ISO 11138-1:2006。医疗保健产品灭菌——生物学指标——第1部分：通用要求。第2版。弗吉尼亚州阿灵顿： AAMI

出版社。

3. ANSI/ AAMI /ISO 11138-2:2006。医疗保健产品灭菌——生物指示剂——第2部分：环氧乙烷灭菌工艺的生物指示剂。第3版。弗吉尼

亚州阿灵顿： AAMI 出版社。

4. ANSI/ AAMI /ISO 11138-3:2006。医疗保健产品灭菌——生物指示剂——第3部分：湿热灭菌工艺的生物指示剂。第1版。弗吉尼亚州阿

灵顿： AAMI 出版社。

5. ANSI/ AAMI /ISO 11138-4:2006。医疗保健产品灭菌——生物指示剂——第4部分：干热灭菌工艺的生物指示剂。第1版。弗吉尼亚州

阿灵顿： AAMI 出版社。

6. Pflug IJ. 《微生物学与灭菌过程工程导论课程大纲》。第4版。明尼苏达州圣保罗：环境灭菌服务公司；1980年。

7. Pflug IJ，Smith GM. 生物指示剂在湿热灭菌过程监测中的应用。载于：Gaughran ERL ，Kereluk K（编）《医疗产品灭菌》。新泽西州

新不伦瑞克：强生公司；1977：193–230。

8. Holcomb RG，Pflug IJ. 分析定量检测微生物灭活数据的Spearman-Karber方法。载于：Pflug IJ（编）.《微生物学与工程灭菌

工艺》。明尼苏达州圣保罗：环境灭菌服务公司；1979年。

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