美国药典 USP 2025〈51〉 抗微生物有效性测试

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状态：当前状态为正式生效，生效日期为2025年2月12日
生效日期：自2018年5月1日起生效
文件类型：通用章节
文档ID：GUID-772FE032-8921-4345-810E-945EF5BF1B15_3_en-US
DOI：https://doi.org/10.31003/ USPNF_M98790_03_01
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〈51〉 抗微生物有效性测试
引言
抗菌防腐剂是添加到水性药品中的物质。非无菌剂型可能添加防腐剂，以防止生产过程中或之后意外引入的微生物滋生。对于包装在多剂
量容器中的无菌药品，添加抗菌防腐剂旨在抑制因反复抽取单剂量而可能引入的微生物生长。所有无菌多剂量包装单元中均应含有至少一种
抗菌防腐剂。
抗菌防腐剂不得作为良好生产规范的替代品，仅用于减少非无菌产品的活微生物数量，或控制多剂量制剂在生产过程中的预灭菌生物负
载。药典剂型中的抗菌防腐剂符合通用说明5.20添加物质的要求。
所有有效的抗菌剂均为有毒物质。为最大限度保护患者，最终包装产品中经证实有效的防腐剂浓度，应低于根据该药品推荐剂量对人体可
能产生的毒性水平。
〈
〈
如果制剂中的活性成分具有内在抗菌活性，则添加的抗菌防腐剂浓度可保持在最低水平。对于所有装在多剂量容器中的注射剂或其他含有抗
菌防腐剂的产品，必须证明其抗菌有效性——无论是产品本身固有的抗菌效果，还是因添加抗菌防腐剂而产生的效果。对于水基制剂、多剂量
外用及口服剂型，以及其他剂型（如眼科、耳科、鼻腔、冲洗和透析液）均需证明其抗菌有效性（参见药物剂型 〉）。在本测试中，水
溶液的定义为水活度大于0.6（参见水活度测定在非无菌药品 〉）。
挑战性微生物的选择通常基于药品可能存在的污染物，并综合考虑其物理特性、配方及预期用途。本测试中规定的标准挑战性微生物组
合，并不妨碍在认为有必要评估特定产品防腐体系生物活性时，纳入其他微生物种类。这些补充性挑战性微生物不在本章讨论范围内，但
可作为所述测试微生物之外的补充使用。
一般程序
本章提供了验证添加抗菌防腐剂有效性的检测方法。此类抗菌防腐剂必须在产品标签上明确标注。有效性检测方法及验收标准适用于制造商
原始密封包装的产品（产品类别详见表1）。测试无需在这些包装容器内进行，但需注意避免使用可能与防腐剂发生相互作用的材料。
生长促进程序及回收方法的适用性
一般考虑因素
必须确定该检测方法在存在适当中和后的待测产品的情况下，能够有效检测出攻击性微生物。若材料或方法发生变更，或产品本身或其直
接接触材料发生可能影响检测结果的变化，则必须重新确认该方法的适用性。
必须确认本操作所用培养基的促生长能力。
测试菌株的制备
使用标准化的测试菌株悬浮液，或按以下方法制备。采用种子批次培养维持技术（种子批次系统），以确保用于接种的活微生物与原始主
种子批次的传代次数 NMT 五代。分别培养所有细菌和真菌测试菌株（详见表2）。
使用以下微生物的培养物： 白色念珠菌（ATCC 编号10231）、巴西曲霉（ATCC 编号16404）、大肠杆菌（ATCC 编号8739）、铜绿假
单胞菌（ATCC 编号9027）和金黄色葡萄球菌（ATCC 编号6538）。本操作中使用的活微生物应来自新鲜生长的培养物（例如处于对数生长
期），但巴西曲霉孢子除外。接种物培养的条件详见表2，适宜培养基为大豆-酪蛋白消化培养基或沙氏葡萄糖琼脂培养基。
为收集细菌及白色念珠菌培养物，使用无菌TS生理盐水冲洗表面生长物，并将其收集至合适的容器中。为收集巴西念珠菌的孢子，应使用含0.05%聚山梨
酯80的无菌TS生理盐水。孢子悬液需保持无菌状态。
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2025年2月12日下午2:09 USP- NF 〈51〉抗菌有效性试验
需进行处理（例如通过无菌玻璃棉过滤）以去除菌丝。所有微生物悬液的制备均应确保接种物中的残留培养基不会残留（例如：经离心后，
用适当的无菌悬浮液重新悬浮）。
另一种方法是：将原代培养的微生物接种于适宜的液体培养基（如大豆-酪蛋白消化肉汤或沙氏葡萄糖肉汤）中培养，通过离心收集细
胞，经洗涤后重悬于无菌悬浮液中。用于接种的微生物悬液需调整至约1×10 cfu/mL的菌落形成单位浓度。细菌和酵母悬液应在2小时内使
用；若储存于2°C至8°C条件下，则可在24小时内使用。稳定的芽孢悬液可预先制备，并在2°C至8°C条件下保存长达7天。[注：接种浓度可
通过浊度测定法对目标微生物进行估算，随后通过平板计数法进行验证。]
培养基的促生长作用
本操作所使用的培养基必须能够支持微生物生长。应对每批预配培养基以及每批由脱水培养基或所述原料制备的培养基进行检测。
对于固体培养基，所获得的计数值必须至少达到标准化接种物计算值的50%。对于新鲜配制的接种物，微生物的生长情况与先前使用
经测试且获批的培养基批次所获得的结果相当。
计数方法在产品存在情况下的适用性
制备10 稀释液时，将1 mL产品（按体积计）加入9 mL生理盐水或其他中和稀释剂中。按此稀释方案继续稀释至10 和10 浓度。向每管
稀释后的产品中加入适量攻击菌株，混匀后从各稀释度中取适量涂布平板，使细菌和酵母菌的菌落形成单位（cfu）数低于250/平板（理想值为
25-250 cfu），或巴西放线菌（A. brasiliensis）的菌落形成单位数低于80/平板（理想值为8-80 cfu）。该平板培养至少需重复两次（但增加重
复次数有助于降低平板计数结果的变异度）。本操作的阳性对照方法是将相同接种物加入生理盐水中，并将等体积生理盐水转移至琼脂平板。
合适的回收方案应能使生理盐水对照组的菌落数（平均值）至少达到50%。
〈
若稀释后的产物具有抗菌特性，则可能需要在稀释液或回收介质中加入特定中和剂。更多信息请参阅《药典品项微生物回收率验证》
〉。
若方法适用性要求进行显著稀释（10 或10 ），则该检测方法评估防腐剂效力的能力可能受到影响，因为这会影响测得的回收率（例
如，对于10 –10 的接种量，可能难以测得3个对数单位的减少）。若未找到合适的中和剂或方法，且方法适用性要求显著稀释，则可使用
更高浓度的接种量（例如10 –10 ），以确保能够测得3个对数单位的减少。报告的平均回收率不得低于1 cfu/平板（若在10 稀释度下每孔
接种1 mL样本并进行双重复测定，则平均回收率应不低于100 cfu/mL）。
可采用膜过滤技术对较大体积的稀释液进行过滤，以克服这一难题或辅助中和其抗菌特性。
产品测试
产品类别
为便于测试，药典条目被划分为四类（见表1）。这些产品的抗菌有效性标准取决于给药途径。预计含有防腐剂的制剂无论采用多剂量包
装还是单剂量包装，均能满足最低有效性标准。
表1. 药典产品类别
类别 产品描述
注射剂；其他注射用制剂，包括乳剂、耳用制剂、无菌鼻用制
剂以及以水性基质或载体制成的眼科制剂
以水性基质或载体制成的局部用产品；非无菌鼻用产品及乳剂，
包括应用于黏膜的产品。
除抗酸剂外，由水性碱或载体制成的口服制剂
以水性碱为基质制成的抗酸剂
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程序
该操作可采用以下两种方式之一进行：若每个容器内均有足量产品且产品容器可无菌进入（即通过弹性橡胶塞插入针头和注射器），则可
在五个原始容器中进行；或使用五个已转移足量产品的无菌、带盖的细菌学容器[对抗菌剂呈惰性]，容器尺寸需合适。用预先制备并标准化的
接种物之一接种每个容器后混合。所用悬浮接种物的体积应占产品总体积的0.5%至1.0%，以最大限度降低对产品的影响。添加至产品中的测
试微生物浓度（第1、2或3类）应确保接种后测试制剂的最终浓度为1×10 至1×10 cfu/mL。对于第4类产品（抗酸剂），接种后测试制剂的
最终浓度应为1×10 至1×10 cfu/mL。
〈
表2. 接种物制备的培养条件
生物体
合适的
中等
孵育
温度
接种物
孵育时间
微生物恢复培养时间
大肠杆菌
（ATCC 编号：8739）
大豆-酪蛋白消化液；大
豆-酪蛋白消化琼脂 3–5天
铜 绿 假 单 胞 菌
（ATCC 编号：
9027）
大豆-酪蛋白消化液；大
豆-酪蛋白消化琼脂 3–5天
金 黄 色 葡 萄 球 菌 （ATCC 编
号：6538）
大豆-酪蛋白消化液；大
豆-酪蛋白消化琼脂 3–5天
白念珠菌
（ATCC 编号：10231）
萨 布 罗 德 葡 萄 糖 琼
脂；
沙保罗葡萄糖肉汤 3–5天
巴西曲霉（ATCC 编
号：16404）
萨 布 罗 德 葡 萄 糖 琼
脂；
沙保罗葡萄糖肉汤 6–10天3–7天
抗菌有效性评价标准
表3. 待测微生物的判定标准
适用于第1类产品
细菌
第7天时，NLT较初始计算值降低1.0个对数单位。
NLT 3.0：第14天时较初始计数出现对数级下降，且第28天时较第14天
的计数未见增加。
每个测试制剂中活微生物的初始浓度是根据平板计数法测定的各标准化接种物中微生物浓度来估算的。将接种后的容器置于22.5 ± 2.5°C条
件下培养。按表3规定的适当时间间隔对每个容器进行采样，并记录这些时间点观察到的外观变化。通过平板计数法测定每个测试制剂在相应
时间点的菌落形成单位（cfu）数量（详见微生物计数试验 〉中的通用程序）。平板计数至少使用两块重复平板进行，计算推导出的cfu/mL
值前需取平均值。若采用膜过滤法，则每次测定均使用两块重复膜滤器。利用试验开始时计算得到的cfu/mL浓度，计算各微生物在相应测试
时间点的cfu/mL浓度 值变化，并以对数减少值表示浓度变化。对数减少值定义为悬浮液中初始浓度（单位：cfu/mL）的 单位值与该
时间点存活菌数（单位：cfu/mL）的 单位值之间的差值。
若符合表3中规定的标准，则抗菌有效性要求即得到满足（详见通用说明，7.测试结果）。计数“无增加”定义为 NMT 0.5 单位高于
其对比值。
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标签： #测试 #微生物 #USP

摘要：

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