美国药典 USP 2025〈89〉 作为制药生产辅助材料使用的酶

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状态：当前状态为正式生效，生效日期为2025年2月12日
生效日期：自2021年12月1日起生效
文件类型：通用章节
文档ID：GUID-2814E59A-96F2-4322-A7D6-2FDCA90B9AA2_2_en-US
DOI：https://doi.org/10.31003/ USPNF_M7728_02_01
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〈89〉 作为制药生产辅助材料使用的酶
引言
本章旨在阐述生物制药生产中使用的酶制剂的质量属性、相关检测方法及其验收标准。生物制药生产过程中使用的辅助材料（包括酶）
的质量会对治疗产品产生直接影响。此类细胞加工过程中会使用多种酶，例如胰蛋白酶、胶原酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶。本章不讨论这
些酶的具体应用，而是重点介绍用于评估其作为工艺材料质量的检测方法。
重组胰蛋白酶
23,463（适用于 β -胰蛋白酶）CAS RN ®：9002-07-7。
定义
重组胰蛋白酶是生物制药生产中的关键原料，作为一种丝氨酸蛋白酶，它主要在精氨酸和赖氨酸氨基酸的羧基末端切割肽链。重组胰蛋
白酶的氨基酸序列与猪胰腺来源的胰蛋白酶完全相同，且该酶是通过基于重组DNA技术在毕赤酵母（Pichia pastoris）中生产的。因此，本
章所述的质量标准仅适用于在酵母中生产的重组猪胰蛋白酶。由于采用重组生产工艺，重组胰蛋白酶不含糜蛋白酶。目前已知胰蛋白酶存
在两种活性形式： β -胰蛋白酶（分子量23,463道尔顿）和 α -胰蛋白酶（分子量23,481道尔顿）。 β -胰蛋白酶在Arg 与Val 、Lys
与Ser 或Lys 与Ala 之间的肽键处发生自溶，可产生三种可能的 α -胰蛋白酶亚型。所有亚型均通过二硫键连接并保持正确的折叠
结构。由于肽键的水解作用， α -胰蛋白酶的分子量比 β -胰蛋白酶大18道尔顿。根据纯度检测中所述的 HPLC 程序测定， β -胰蛋白酶的峰
面积不低于70%， α -胰蛋白酶的峰面积 NMT 20%。以测定方法中规定的 carbobenzoxy-valyl-glycyl-arginine-4-nitril-anilide 乙酸为底物
时，其比活性不低于180单位/毫克蛋白质。
[注——以carbobenzoxy-valyl-glycyl-arginine-4-nitril-anilide 乙酸盐为底物时，1单位胰蛋白酶活性相当于21 USP胰蛋白酶单位。1 USP胰蛋
白酶单位是指在胰蛋白酶专论规定的测定条件下（以N-苯甲酰基-L-精氨酸乙酯盐酸盐为底物），引起吸光度变化为0.003/min的酶活性。因
此，以 carbobenzoxy-valyl-glycyl-arginine-4-nitril-anilide 乙酸盐为底物时，重组胰蛋白酶的比活性为180单位/毫克蛋白质，相当于3800
USP胰蛋白酶单位/毫克蛋白质。]
识别；鉴定
A. 它符合检测方法中的要求。
B.样品溶液中 β-胰蛋白酶主峰的保留时间与纯度检测中获得的标准溶液一致。
化验
修改为：
程序
缓冲液：将1.21克三（羟甲基）氨基甲烷和0.29克二水合氯化钙溶解于100 mL水中，并用2 N盐酸调节至pH 8.0（温度为25 ± 1 °C）。
底物储备溶液：将精确称取的20 mg carbobenzoxy-valyl-glycyl-arginine-4-nitril-anilide 乙酸盐溶解于3.0 mL水中。[注——仅可使用新鲜
配制的溶液。]
OFFICIAL
2025年2月12日下午2:16 USP- NF 〈89〉：作为制药生产辅助材料的酶类
底物溶液：通过混合28 mL缓冲液与2.8 mL底物储备液制备溶液。[注—仅可使用新鲜配制的溶液。]
▲▲
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▲
▲
▲
▲
标准溶液：将USP__胰蛋白酶__重组猪RS与水预冷却至约4°C。温度达到4°C后立即开始配制标准溶液。每种标准溶液均按1:68,921的比例
用水稀释USP__胰蛋白酶__重组猪RS制备。至少平行制备五份标准溶液，每份标准溶液均进行双重复测定。[注——每次测量和稀释操作
均使用可调节移液器；配制标准溶液和样品溶液时使用 低蛋白 ▲（USP 2021年12月版）试管；转移样品时使用 低蛋白 ▲
（USP 2021-12月-）移液枪头，其配备 低蛋白 ▲（USP 2021-12月-）滤膜。转移前移液枪头不得湿润，且每个移液枪头仅用于
转移单个样品。[注——可通过三个稀释步骤实现1:68,921的稀释比例，每一步均为1:41稀释（1:41/1:41/1:41）。例如，对于初始稀释：使
用配备 低蛋白 （USP 1-Dec-）吸头且含 低蛋白 ▲（USP 1-Dec-2021）滤膜的移液器吸取0.1 mL USP__胰蛋白酶__重组
猪RS；擦拭吸头外表面去除残留溶液，将参比标准品加入装有4.0 mL预冷水的 低蛋白 ▲（USP 1-Dec-2021）试管中，上下吸打溶液
2–3次冲洗吸头，弃去吸头后用涡旋混匀仪以最大转速混合溶液约2秒。第二、三步稀释的操作流程与初始稀释相同，仅需从前一步稀释步
骤转移0.1 mL溶液。]
样品溶液制备：按照标准溶液的制备说明，平行制备至少五份重组胰蛋白酶样品溶液，使用预冷的水作为稀释剂，使最终浓度至少达到0.16
单位/毫升。每份样品溶液均进行两次重复检测。仪器检测条件
〈（参见紫外-可见光谱法 〉。）
模式：UV
分析波长：405 nm
路径长度：1厘米
温度：25° 系统适
用性
样品：标准溶液和样品溶液
适用性要求：标准溶液和样品溶液的 ΔA /min（下文计算得出）应为0.03–0.07。标准溶液的平均计算活性值应为标签标注值的90%–1
10%。
分析
样品：标准溶液和样品溶液
▲
转移1.10 mL底物溶液至 低蛋白 ▲（USP 1-Dec-）半微量比色杯中，待温度稳定后，检查比色杯温度是否符合要求，并
静置10分钟。通过加入0.020 mL标准溶液或样品溶液启动反应。记录至少5分钟内的吸光度值，并在反应线性范围内计算每分钟吸光
度变化值（ΔA /min）。
计算重组胰蛋白酶的活性（单位：单位/毫升）：
=反应混合物的体积，1.12 mL
ε= 405 nm处的消光系数，10.4（mmol ·1 cm ）
=标准溶液或样品溶液的体积，0.020 mL
=吸收路径长度，1厘米
ΔA /分钟 =每分钟吸光度变化值
=稀释因子
[注——在检测条件下，One Unit每分钟可从 carbobenzoxy-valyl-glycyl-arginine-4-nitril-anilide 乙酸酯中释放相当于1 mmol的4-腈基苯
胺。]
计算重组胰蛋白酶的比活性（单位：单位/毫克蛋白质）：
结果 =活动/C
活性 =重组胰蛋白酶的活性（按先前计算结果，单位：单位/毫升）
=重组胰蛋白酶的蛋白质浓度（mg/mL）
验收标准
特异性活性：NLT 180 单位/毫克蛋白质
相对标准偏差：基于5次重复实验测定的活性值 NMT 5%
安全；安保
活动量 = [ /( ε× V × B)] × ( ΔA /分钟) × D
OFFICIAL
2025年2月12日下午2:16 USP- NF 〈89〉：作为制药生产辅助材料的酶类
程序
溶液A：用水稀释1 mL磷酸（85%），至总体积为1000 mL。
方案B：用乙腈将1 mL磷酸（85%）稀释至1000 mL。
流动相：参见表1。
表1
时间
(分)
解决方案 A解决方案 B
标准溶液：在室温下将100 µL USP胰蛋白酶重组猪RS解冻约1小时，混匀后转移至 HPLC 小瓶中。目标蛋白浓度应为70±10 mg/mL。
样品溶液制备方法：将100 µL 重组胰蛋白酶在室温下解冻约1小时，混合后转移至 HPLC 小瓶中。目标蛋白浓度应为70±10 mg/mL。
[注——若标准溶液和样品溶液在制备后未立即准备注射，则应将其保存于2°–8°环境中。]
色谱系统
〈（参见色谱法 〉，系统适用性。）
模式：LC
检测器：UV 280 nm
柱体尺寸：4.6毫米×25厘米；采用3- µm L1填料，孔径为200埃
柱温：40°C
流速：1.0 mL/min
注射体积：1 µL
系统适用性
样品：标准溶液
[注——重组胰蛋白酶主峰的保留时间为12–17分钟。]适用性要求
分辨率： α-胰蛋白酶与 β-胰蛋白酶峰之间的NLT 1值分析
样品：样品溶液
记录色谱图并测量峰面积。采用面积百分比法评估胰蛋白酶的纯度。积分时间为25分钟。空白样品应纳入积分计算。对于以 α-胰蛋
白酶前肩峰形式洗脱的峰，仅当形成最小值时采用垂直滴定法进行积分；对于以 β-胰蛋白酶后肩峰形式洗脱的峰，仅当形成最小值时
采用切线积分法进行评估。
验收标准： β-胰蛋白酶峰面积的允许偏差不超过70%，α-胰蛋白酶特异性检测峰面积的允许偏差不超过
20%。
修改为：
蛋白质含量
4 N盐酸溶液：将10.4 mL 25%盐酸与9.6 mL水混合。
储存缓冲液：将2.9克二水合氯化钙溶于水中，加入2.5 mL 4 N盐酸溶液，用水稀释至最终体积为1000 mL。必要时，用4 N盐酸溶液调节pH
至2.0 ± 0.2。
样品溶液制备：向3 mL储存缓冲液中加入0.025 mL重组胰蛋白酶。实验至少重复三次。
空白溶液：储存缓冲液，3 mL
仪器条件
▲
▲（参见紫外-可见光谱法〈857〉。） （美国药典 2021年12月版）
模式：UV
分析波长：280 nm
路径长度：1厘米
系统适用性
OFFICIAL
2025年2月12日下午2:16 USP- NF 〈89〉：作为制药生产辅助材料的酶类

标签： #USP #制药

摘要：

状态：当前状态为正式生效，生效日期为2025年2月12日生效日期：自2021年12月1日起生效文件类型：通用章节文档ID：GUID-2814E59A-96F2-4322-A7D6-2FDCA90B9AA2_2_en-USDOI：https://doi.org/10.31003/USPNF_M7728_02_01DOIRef:k4d1v©2025USPC请勿分发〈89〉作为制药生产辅助材料使用的酶引言本章旨在阐述生物制药生产中使用的酶制剂的质量属性、相关检测方法及其验收标准。生物制药生产过程中使用的辅助材料（包括酶）的质量会对治疗产品产生直接影响。此类细胞加工过程中会使用多种酶，例如胰蛋白酶、胶...

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