美国药典 USP 2025〈89.2〉胶原酶 II

VIP免费
3.0 安心365 2026-04-30 1 1.12MB 6 页 80质量币
侵权投诉
状态：当前状态为正式生效，生效日期为2025年2月12日
官方日期：自2022年9月1日起生效
文件类型：通用章节
文档ID：GUID-32440FDF-3C04-43A3-B336-79472EBDC90B_2_en-US
DOI：https://doi.org/10.31003/ USPNF_M9699_02_01
请勿分发
〈89.2〉胶原酶 II
112,023（针对 ζ 亚型）CAS RN ®：9001-12-1。
定义
胶原酶II（EC 3.4.24.3）是从溶组织梭菌中分离得到的，由colH基因编码（GenBank登录号BAA06251.1），是用于解离或破坏多种组织
类型的关键原料。该酶属于金属蛋白酶，兼具内切蛋白酶和 tripeptidylcarboxypeptidase 酶活性；其主要切割位点位于人胶原双链氨基酸甘
氨酸–脯氨酸之前，水解作用发生在胶原蛋白的三螺旋结构域内部。
胶原酶II亦称为II类胶原酶，包含三种亚型： δ、ε和ζ。胶原酶II ζ为全长酶形式；而胶原酶II δ（分子量100,000 Da）和胶原酶II ε
（分子量110,000 Da）被认为是胶原酶II ζ经溶组织梭菌中其他蛋白酶（主要是胰蛋白酶样酶及clostripain/内切蛋白酶Arg C）作用后的蛋
白水解降解产物。
胶原酶II可采用液体制剂形式提供，该制剂由5 mM N-2-hydroxyethylpiperazine-N′-2-ethanesulfonic 酸（HEPES）和1 mM氯化钙组成
（pH 7.5），并以冷冻液体形式储存。使用4-苯基偶氮苄氧羰基（PZ）-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg作为底物（具体方法详见检测方法），胶原
酶II的比活性为10–16单位/毫克蛋白质。根据纯度检测中所述的 HPLC 方法测定，胶原酶II的峰面积占比不低于90%。氯链蛋白酶活性检测
用于评估氯链蛋白酶杂质的活性，其验收标准为 NMT 0.5单位/毫克蛋白质；胰蛋白酶活性检测用于评估类胰蛋白酶杂质的活性，其验收标
准同样为 NMT 0.5单位/毫克蛋白质。
识别；鉴定
A. 它符合检测方法中的要求。
B. 样品溶液主峰的保留时间与纯度检测中获得的标准溶液一致。
化验
修改为：
程序
Tris缓冲液：0.1 M Tris，pH 7.1，制备方法如下：将6.05克三（羟甲基）氨基甲烷（Tris）溶解于400 mL水中，用2 N盐酸调节至pH
7.1（温度为25 ± 1 °C）。用水稀释至最终体积为500 mL。
底物溶液：将10 mg PZ -Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg溶解于0.2 mL甲醇中，然后用Tris缓冲液稀释至最终体积为10 mL。[注——仅可使用新
鲜配制的溶液。]
氯化钙溶液：0.1 M，制备方法如下。在容量瓶中称取1.47克二水合氯化钙，用水稀释至最终体积为100 mL。
柠檬酸溶液：0.025 M，制备方法如下：在容量瓶中称取525 mg一水合柠檬酸，用水稀释至最终体积为100 mL。
OFFICIAL
2025年2月12日下午2:17 USP- NF 〈89.2〉胶原酶II
提取混合液：对于每个待测样品，向一个试管中加入5.0 mL乙酸乙酯和1.0 mL柠檬酸溶液。[注——仅可使用新鲜配制的混合液。]
▲
干燥管：取每个待测样品置于一个试管中，加入0.35–0.40克无水硫酸钠。用石蜡膜密封试管。标准溶液：用Tris缓冲液 将USP胶原酶II
RS稀释至适当稀释度，使分析所得吸光度范围为0.3–0.9。▲(IRA 1-2022年9月- ) [注——避免冷冻和解冻USP胶原酶II RS。取出USP胶
原酶II RS后，擦拭塑料移液枪头外表面以清除残留溶液。]
样品溶液制备方法：用Tris缓冲液将胶原酶II稀释至适当浓度，使分析所得吸光度值达到0.3–0.9范围。每份样品制备三次。[注意——避免
对胶原酶II样品进行冻融操作。吸取胶原酶II样品后，用纸巾擦拭移液管尖端外表面以去除残留溶液。]
仪器条件
〈
（参见紫外-可见光谱法 〉。）
模式：UV
分析波长：320 nm
路径长度：1厘米
温度：25°C
分析
样品：标准溶液和样品溶液
取1.0 mL底物溶液和0.2 mL氯化钙溶液加入试管中，将试管温度调节至25°C。通过加入0.05 mL标准溶液或各样品溶液启动反应。用
0.05 mL Tris缓冲液替换标准溶液或样品溶液制备空白对照。混合后在25°C下孵育精确15分钟。将0.5 mL反应液转移至含有6.0 mL萃取
混合液的试管中，立即涡旋振荡20秒。使用玻璃移液管将乙酸乙酯相（上层）转移至干燥管中，并充分涡旋混匀。用巴斯德移液管将上
清液转移至适用于紫外吸光度测定的一次性半微量比色皿中，记录吸光度值。
计算胶原酶II的活性（单位：每毫升）：
ε= 320 nm 处的消光系数，21（1 cm ²· µmol ¹）
V = 标准溶液或样品溶液的体积，0.05 mL
V = 转移至萃取混合物中的反应体积，0.5 mL
B = 吸收路径长度，1厘米
T = 孵育时间，15分钟
D = 稀释因子
[注——在本检测条件下，每分钟一个单位可从 PZ -Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg中释放相当于1 µmol PZ -Pro-Leu的量。]
计算胶原酶II的比活性（单位：每毫克蛋白质）：
结 果 =活 性 /C 活
性=胶原酶II活性（单位/毫升）
=蛋白质浓度（mg/mL）
系统适用性
样品：标准溶液和样品溶液
适用性要求
平均计算活性：标签标注值的85%–1 15%，标准溶液
吸光度：标准溶液与样品溶液均为0.3–0.9；验收标准：10–16单位/
毫克蛋白质
安全；安保
程序
结果 = (A −) × [ × /( ε× V × × B × T)] × D 其中：
DA = 标准溶液或样品溶液的吸光度
A = 空白吸光度B
V = 反应混合物的体积，1.25 mL T
=提取混合物中乙酸乙酯的体积，5.0 mL
OFFICIAL
2025年2月12日下午2:17 USP- NF 〈89.2〉胶原酶II
溶液A：20 mM Tris和1 mM氯化钙，pH 7.5，制备方法如下：将2.42 g Tris和147 mg氯化钙二水合物溶解于900 mL水中。用2 N盐酸调
节至pH 7.5。用水稀释至最终体积为1000 mL。
溶液B：20 mM Tris、1 mM氯化钙和1 M氯化钠，pH 7.5，制备方法如下：将2.42 g Tris、147 mg二水合氯化钙和58.44 g氯化钠溶解于900
mL水中。用2 N盐酸调节至pH 7.5，最后用水稀释至总体积为1000 mL。
流动相：参见表1。
表1
时间
(分)
解决方案 A解决方案 B
储存缓冲液：5 mM HEPES 和1 mM氯化钙，pH 7.5，制备方法如下：溶解1.19克HEPES 和147毫克钙。
将二水合氯化物溶于900 mL水中。用4 N氢氧化钠溶液调节pH至7.5。用水稀释至最终体积为1000 mL。
标准溶液：使用前将USP胶原酶II RS在室温下解冻并混匀。储存于冰上或5°C条件下。使用前用储存液稀释。
用缓冲液将蛋白质浓度调整至5.5 mg / mL。转移至 HPLC 小瓶中，置于5条件下保存。实验重复两次，每次仅注射一份样本。
样品溶液：用储存缓冲液稀释胶原酶II，使蛋白质浓度达到5.5 mg/mL，并于5°C条件下保存。
空白：存储缓冲区
色谱系统
〈（参见色谱法 〉，系统适用性。）
模式：LC
检测器：UV 280 nm
柱体尺寸：5毫米×5厘米；10 µm 填料
温度
自动进样器：5°
柱：25°
流速：1.5 mL/min
注射体积：20 µL
系统适用性
样品：标准溶液
适用性要求：标准溶液的色谱图与 胶原酶II RS附带提供的典型色谱图一致。
分析
样品：样品溶液
应考虑对空白样品进行积分分析。采用峰面积百分比法评估II型胶原酶的纯度，但需排除与空白样品相关的峰。通过在主峰的前峰
和后峰拐点处绘制垂直线对所有肩峰进行积分，并将其视为独立杂质。保留时间大于25分钟的任何峰均不予考虑。
验收标准：胶原酶II主峰的保留率不低于90%
杂质
CLOSTRIPAIN 活动
磷酸钾缓冲液：0.1 M pH 7.6，制备方法如下。将1.36克一水合磷酸氢二钾溶于水中，稀释至100 mL；将2.28克三水合磷酸氢二钾溶于水中，稀释
至100 mL。将第二溶液的pH调节至
7.6 使用第一种解决方案。
二硫苏糖醇溶液：浓度为0.194 M，制备方法如下：将60 mg二硫苏糖醇（DTT）溶解于2 mL磷酸钾缓冲液中。
氯化钙溶液：0.01 M，制备方法如下：将147 mg二水合氯化钙溶解于100 mL水中。
OFFICIAL
2025年2月12日下午2:17 USP- NF 〈89.2〉胶原酶II

标签： #USP

摘要：

状态：当前状态为正式生效，生效日期为2025年2月12日官方日期：自2022年9月1日起生效文件类型：通用章节文档ID：GUID-32440FDF-3C04-43A3-B336-79472EBDC90B_2_en-USDOI：https://doi.org/10.31003/USPNF_M9699_02_01DOIRef:orx1n©2025USPC请勿分发〈89.2〉胶原酶IICHNOS112,023（针对ζ亚型）CASRN®：9001-12-1。定义胶原酶II（EC3.4.24.3）是从溶组织梭菌中分离得到的，由colH基因编码（GenBank登录号BAA06251.1），是用于解离或破坏...

展开>> 收起<<
美国药典 USP 2025〈89.2〉胶原酶 II.pdf

共6页,预览6页

还剩页未读， 继续阅读

声明：如果您的权利被侵害，请联系我们的进行举报。

相关推荐

更多
立即下载
作者：安心365 分类：专业资料 价格：80质量币 属性：6 页 大小：1.12MB 格式：PDF 时间：2026-04-30

相关内容

更多

热门标签

医疗器械 管理 程序 报告 指南 验证 GB 器械 ISO 控制程序
/ 6
评分 收藏
分享
立即下载 VIP免费下载
客服
关注