美国药典 USP 2025〈60〉非无菌产品的微生物学检测

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状态：当前状态为正式生效，生效日期为2025年2月12日
生效日期：自2019年12月1日起生效
文件类型：通用章节
文档ID：GUID-4C3D84A8-B940-42F0-ABC3-AE9128AA8D95_2_en-US
DOI：https://doi.org/10.31003/ USPNF_M12455_02_01
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▲〈60〉非无菌产品的微生物学检测
—BURKHOLDERIA CEPACIA 复合物检测
引言
本章所述检测方法可确定洋葱伯克霍尔德菌复合体（Bcc）的缺失，该菌可在所述条件下被检测到。
这些检测旨在确定某种物质或制剂是否符合既定的微生物质量标准，和/或评估产品（尤其是吸入用产品或用于口服、口腔黏膜、皮肤或鼻
腔的水性制剂）是否含有Bcc菌群成员。
生长——培养基的促进与抑制特性及用于检测体心立方缺失的试验适用性：对每批预配好的培养基以及每批由脱水培养基或原料制备的培养基均进行
检测。
测试菌株的制备
使用标准化的稳定测试菌株悬液（参见表1），这些菌株需与原始菌株培养物相差 NMT 5代。
表1. 用于促进生长及适用性测试的微生物测试菌株
微生物 标准菌株
洋葱伯克霍尔德菌 ATCC 25416、NCTC 10743 或CIP 80.24
洋葱伯克霍尔德菌 ATCC BAA-245 或LMG 16656
多食伯克霍尔德菌
ATCC BAA-247、LMG 13010、CCUG 34080、CIP 105495、DSM 13243
或NCTC 13007
铜绿假单胞菌 ATCC 9027、NCIMB 8626、CIP 82.1 18 或NBRC 13275
金黄色酿脓葡萄球菌 ATCC 6538、NCIMB 9518、CIP 4.83 或NBRC 13276
微生物
将各测试菌株分别置于大豆-酪蛋白消化肉汤或大豆-酪蛋白消化琼脂培养基中，在30°–35°C条件下培养18–24小时。
使用pH 7.0的缓冲氯化钠-蛋白胨溶液或pH 7.2的磷酸盐缓冲溶液制备测试悬浮液。悬浮液应在2小时内使用；若储存于2°C–8°C条件
下，则可在24小时内使用。如购自供应商，请遵循其说明；若使用自行配制的培养物，则需按照经验证的方法（例如微生物计数试验
〈61〉）进行配制。使用 NMT 100菌落形成单位（cfu）的攻毒接种物进行生长促进和适用性测试。
阴性对照
需设置阴性对照以验证测试条件。微生物不得生长。根据《产品测试》所述方法对产品进行测试时，亦需执行阴性对照。
促生长特性测试，固体培养基
执行表面涂布法（参见微生物计数试验〈61〉、促生长试验、计数方法适用性及阴性对照、产品存在条件下计数方法的适用性、产品存在
时微生物回收率、平板计数法），用少量（NMT 100 CFU）相应微生物（参见表2）接种每块平板。在指定温度下培养 NMT 试验规定的最短
时间。此时微生物的生长情况应与先前使用经测试且获批的培养基批次所获得的结果相当。
表2. 培养基中具有促生长、抑制生长及指示作用的微生物
OFFICIAL
2025年2月12日下午2:11 USP- NF 〈60〉非无菌产品的微生物检验——洋葱伯克霍尔德菌复合群检测
中等 财产 微生物
洋葱伯克霍尔德菌选择性琼脂
促进生长且具有指示作用的
洋葱伯克霍尔德菌，伯克霍尔德菌属
Cenocepacia，又称 Burkholderia multivorans
抑制性的 铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌
抑制特性测试（固相介质）
将至少100 cfu的相应微生物接种于适宜培养基中。在指定温度下培养，培养时间不超过试验规定的最长时间。此时可观察到指定微生物的生长受到
抑制（详见表2）。
指示性特性测试
采用表面涂布法（详见微生物计数试验〈61〉、促生长试验、计数方法适用性及阴性对照、产品存在条件下计数方法适用性、产品存在时
微生物回收率、平板计数法），每块平板接种少量（NMT 100 cfu）指定微生物。在指定温度下按试验规定时间进行培养。所得菌落形态及指
示反应与先前使用经验证批准的培养基批次所获结果一致（见表2）。
测试方法的适用性
必须确定该检测方法在待测产品存在条件下检测Bcc的能力。方法适用性的孵育时间不得超过规定的最短孵育周期。若检测性能或产品发
生可能影响检测结果的变化，则必须确认方法的适用性。
对于每个待测试的新产品，均需按照《产品测试》中的方法进行样品制备。混合时，将各测试菌株加入规定的生长培养基中，并分别接
种。接种后的测试样品中微生物数量应相当于 NMT 100菌落形成单位（cfu）。
按照《产品测试》所述方法进行测试，采用规定的最短培养周期。必须通过《结果判读》中描述的指示反应检测出Bcc微生物。
该产品的任何抗菌活性均需对测试程序进行修改（参见微生物计数试验〈61〉、生长促进试验、计数方法的适用性及阴性对照、产品存在条件下计数方法的
适用性）。
抗微生物活性的中和/消除）。
产品测试
样本制备与预孵育
使用待检测产品1克进行1:10的稀释，制备样品。取10 mL或相当于1克或1 mL的样品量，接种适量的大豆-酪蛋白消化液（具体用量按检测
方法适用性部分所述确定），或使用方法适用性测试中确定的适当稀释度的大豆-酪蛋白消化液（例如，在进行药用水的可选检测时可能需要
1:10的稀释）。随后混合样品，并在30°–35°C条件下孵育48–72小时。
筛选与传代培养
通过划线法在洋葱伯克霍尔德菌选择性琼脂（BCSA）平板上进行传代培养，并于30°–35°条件下培养48–72小时。
口译
BCSA 培养基上出现带有黄色晕圈的绿褐色菌落，或被粉红色-红色区域包围的白色菌落，表明可能存在Bcc菌株。 BCSA 上的任何生长均
需通过鉴定试验确认。更多信息请参阅微生物特征、鉴定与菌株分型〈1113〉。
若未出现所述类型的菌落，或确认性鉴定试验结果为阴性，则该产品符合检测要求。
推荐培养基
【注：本节内容仅供参考。】
本药典试验中规定的用途所采用的以下溶液及培养基均被证实符合要求。若能证明其他培养基的适用性，亦可予以使用。
储备缓冲溶液
将34克磷酸二氢钾转移至1000毫升容量瓶中，用500毫升纯化水溶解，用氢氧化钠调节pH至7.2 ± 0.2，加入纯化水至定容后混匀。分装至容器中并进行
灭菌处理，储存于2°–8°C条件下。
磷酸盐缓冲溶液 pH 7.2。将纯化水与储
备缓冲溶液按800:1（体积比）混合，并进行灭菌处理。
缓冲氯化钠-蛋白胨溶液 pH 7.0
OFFICIAL
2025年2月12日下午2:11 USP- NF 〈60〉非无菌产品的微生物检验——洋葱伯克霍尔德菌复合群检测
按照表3所示方法制备pH 7.0的缓冲氯化钠-蛋白胨溶液。采用经验证的灭菌程序在高压灭菌器中进行灭菌。
表3
磷酸二氢钾
磷酸氢二钠二水合物 7.2克（相当于0.067摩尔磷酸盐）
氯化钠
蛋白胨（肉类或酪蛋白）
纯化水 1000毫升
大豆-酪蛋白消化液
按照表4所述方法制备大豆-酪蛋白消化液。调节pH值，使灭菌后在25°C下的pH值为7.3 ± 0.2。使用经过验证的灭菌程序在高压灭菌器中进行灭
菌。
表4
酪蛋白胰酶消化物
大豆木瓜酶消化物
氯化钠
磷酸氢二钠
一水葡萄糖
纯化水 1000毫升
洋葱伯克霍尔德菌选择性琼脂培养基
按照表5中的说明制备 BCSA 。在内部制备培养基时，首先制备不含抗生素的基础成分。调整pH值，使灭菌后的pH值在25°C下达到6.8 ± 0.3。
使用经过验证的灭菌程序在高压灭菌器中进行灭菌。将基础培养基冷却至45°C–50°C，加入经无菌过滤的抗生素1%溶液，混合后倒入培养皿中。
表5
酪蛋白蛋白胨
乳糖
蔗糖
氯化钠
酵母提取物
酚红
庆大霉素 10.0毫克
万古霉素 2.5毫克
水晶紫 2.0毫克
多粘菌素B
琼脂
去离子水 1000 mL ▲（美国药典 2019年12月1日版）
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2025年2月12日下午2:11 USP- NF 〈60〉非无菌产品的微生物检验——洋葱伯克霍尔德菌复合群检测

标签： #无菌 #检测 #微生物

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