美国药典 USP 2025〈89.1〉胶原酶I
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状态：当前状态为正式生效，生效日期为2025年2月12日
生效日期：自2017年5月1日起生效
文件类型：通用章节
DocId：GUID-56A38808-AE90-4808-B4E2- AA4102B275B0_1（英文版本）_en-US
DOI：https://doi.org/10.31003/ USPNF_M9698_01_01
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〈89.1〉胶原酶I
113,897道尔顿（适用于
β
亚型）CAS RN ®：9001-12-1。
定义
胶原酶I（EC 3.4.24.3）是从溶组织梭菌中分离得到的，由colG基因（GenBank登录号BAA77453.1）编码，是用于解离或破坏多种组织
类型的关键原料。该酶属于金属蛋白酶，兼具内切蛋白酶和 tripeptidylcarboxypeptidase 酶活性；其主要切割位点位于人胶原双链氨基酸甘
氨酸–脯氨酸之前，水解作用主要发生在胶原三螺旋结构域的末端附近。
胶原酶I亦称为I类胶原酶，包含三种亚型： α、β和γ。胶原酶Iβ为全长酶，而胶原酶Iα（分子量68,000 Da）和胶原酶Iγ（分子量
79,000 Da）被认为是胶原酶Iβ经溶组织梭菌中其他蛋白酶（主要是胰蛋白酶样酶及clostripain/内切蛋白酶Arg C）作用后的蛋白水解降解
产物。
胶原酶I可采用液体制剂形式提供，该制剂由5 mM N-2-hydroxyethylpiperazine-N′-2-ethanesulfonic 酸（HEPES）和1 mM氯化钙组成，
pH值为7.5，并以冷冻液体形式储存。使用4-苯基偶氮苄氧羰基（PZ）-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg作为测定方法中所述的底物时，胶原酶I的比
活性为0.10–0.60单位/毫克蛋白质。根据纯度检测中所述的 HPLC 方法测定，胶原酶I的峰面积占比不低于90%。氯链蛋白酶活性检测用于
评估氯链蛋白酶杂质的活性，其验收标准为 NMT 0.5单位/毫克蛋白质；胰蛋白酶活性检测用于评估类胰蛋白酶杂质的活性，其验收标准同
样为 NMT 0.5单位/毫克蛋白质。
识别；鉴定
A. 它符合检测方法中的要求。
B. 样品溶液主峰的保留时间与纯度检测中获得的标准溶液一致。
化验
程序
Tris缓冲液：0.1 M Tris，pH 7.1，制备方法如下：将6.05克Tris（羟甲基）氨基甲烷（Tris）溶解于400 mL水中，用2 N盐酸调节至pH
7.1（温度为25 ± 1 °C），最后用水稀释至终体积为500 mL。
底物溶液：将10 mg PZ -Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg溶解于0.2 mL甲醇中，用Tris缓冲液稀释至最终体积为10 mL。[注——仅可使用新鲜配
制的溶液。]
氯化钙溶液：0.1 M，制备方法如下：在容量瓶中称取1.47 g二水合氯化钙，用水稀释至最终体积为100 mL。
柠檬酸溶液：0.025 M，制备方法如下：在容量瓶中称取525 mg一水合柠檬酸，用水稀释至最终体积为100 mL。
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2025年2月12日下午2:17 USP- NF 〈89.1〉胶原酶I
提取混合液：对于每个待测样品，向一个试管中加入5.0 mL乙酸乙酯和1.0 mL柠檬酸溶液。[注——仅可使用新鲜配制的混合液。]
干燥管：取每个待测样品置于一个试管中，加入0.35–0.40克无水硫酸钠。用石蜡膜密封试管。标准溶液：用Tris缓冲液将USP胶原酶I RS稀
释至1:50至1:100（体积比）。[注意——避免冷冻和解冻 胶原酶I RS。吸取USP胶原酶I RS后，擦拭塑料移液枪头外侧以去除残留溶
液。]样品溶液：用Tris缓冲液将胶原酶I稀释至适当浓度，使分析所得吸光度值为0.3–0.9。每份样品制备三个重复样本。[注意——避免冷冻
和解冻胶原酶I样品。吸取胶原酶I样品后，擦拭枪头外侧以去除残留溶液。]
仪器条件
〈
（参见紫外-可见光谱法 〉。）
模式：UV
分析波长：320 nm
路径长度：1厘米
温度：25°C
分析
样品：标准溶液和样品溶液
取1.0 mL底物溶液和0.2 mL氯化钙溶液加入试管中，将试管温度调节至25°C。通过加入0.05 mL标准溶液或各样品溶液启动反应。用
0.05 mL Tris缓冲液替换标准溶液或样品溶液制备空白对照。混合后在25°C下孵育精确15分钟。将0.5 mL反应液转移至含有6.0 mL萃取
混合液的试管中，立即涡旋振荡20秒。使用玻璃移液管将乙酸乙酯相（上层）转移至干燥管中，并充分涡旋混匀。用巴斯德移液管将上
清液转移至适用于紫外吸光度测定的一次性半微量比色皿中，记录吸光度值。
计算胶原酶I的活性（单位：单位/mL）：
ε= 320 nm处的消光系数，21（1 cm ²· µmol ）
V = 标准溶液或样品溶液的体积，0.05 mL
V = 转移至萃取混合物中的反应体积，0.5 mL
B = 吸收路径长度，1厘米
T = 孵育时间，15分钟
D = 稀释因子
[注——在本检测条件下，每分钟一个单位可从 PZ -Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg中释放相当于1 µmol PZ -Pro-Leu的量。]
计算胶原酶I的比活性（单位：单位/毫克蛋白质）：
结 果 =活 性 /C 活
性=胶原酶I的活性（单位/毫升）
=蛋白质浓度（mg/mL）
系统适用性
样品：标准溶液和样品溶液
适用性要求
平均计算活性：标签标注值的85%–1 15%，标准溶液
吸光度：标准溶液与样品溶液均为0.3–0.9；验收标准：0.10–0.60
单位/毫克蛋白质
安全；安保
程序
溶液A：20 mM Tris和1 mM氯化钙，pH 7.5，制备方法如下：将2.42克Tris和147毫克二水合氯化钙溶解于900 mL水中，用2 N盐酸调节pH至
7.5，最后用水稀释至总体积为1000 mL。
结果 = (A −) × [ × /( ε× V × × B × T)] × D 其中：
DA = 标准溶液或样品溶液的吸光度
A = 空白吸光度B
V = 反应混合物的体积，1.25 mL T
=提取混合物中乙酸乙酯的体积，5.0 mL
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溶液B：20 mM Tris、1 mM氯化钙和1 M氯化钠，pH 7.5，制备方法如下：将2.42 g Tris、147 mg二水合氯化钙和58.44 g氯化钠溶解于900
mL水中，用2 N盐酸调节pH至7.5，最后用水稀释至总体积为1000 mL。
流动相：参见表1。
表1
时间
(分)
解决方案 A解决方案 B
储存缓冲液：5 mM HEPES 和1 mM氯化钙，pH 7.5，制备方法如下：将1.19克HEPES 和147毫克二水合氯化钙溶解于900毫升水中，用4
N氢氧化钠溶液调节pH至7.5，最后用水稀释至总体积为1000毫升。
标准溶液：使用前将USP胶原酶I RS在室温下解冻并混匀。储存于冰上或5°C条件下。使用前用储存液稀释。
用缓冲液将蛋白质浓度调整至5.5 mg / mL。转移至 HPLC 小瓶中，置于5℃条件下保存。实验重复两次，每次仅注射一份样本。
胶原酶II溶液：使用前将USP胶原酶II RS在室温下解冻并混匀。储存于冰上或5°C条件下。用……稀释。
使用储存缓冲液将蛋白质浓度调整至5.5 mg / mL。转移至 HPLC 小瓶中，置于5°C条件下保存。实验设置双份样本，每份样本注射一
次。
样品溶液：用储存缓冲液稀释胶原酶I，使蛋白质浓度达到5.5 mg/mL，并于5°C条件下保存。
空白：存储缓冲区
色谱系统
〈
（参见色谱法 〉，系统适用性。）
模式：LC
检测器：UV 280 nm
柱体尺寸：5毫米×5厘米；采用10 µm L91填料
温度
柱：25°
自动进样器：5°
流速：1.5 mL/min
注射体积：20 µL
系统适用性
样品：标准溶液
适用性要求：标准溶液的色谱图与 胶原酶I RS附带提供的典型色谱图一致。
分析
样品：样品溶液
应考虑对空白样品进行积分分析。通过将其保留时间与胶原酶II溶液中的主峰进行比较，确定对应于胶原酶II的峰。采用面积百分比
法评估胶原酶I的纯度，但需排除与空白样品相关的峰。通过在主峰的拐点处绘制垂直线对主峰前部和尾部的所有肩峰进行积分，并将
其视为独立杂质。保留时间大于25分钟的任何峰均不予考虑。
检测标准：胶原酶I主峰的检测灵敏度不低于90%，胶原酶II的NMT 不低于3%。
杂质
CLOSTRIPAIN 活动
磷酸钾缓冲液：0.1 M pH 7.6，制备方法如下：将1.36克一水合磷酸钾溶于水中，稀释至100 mL；将2.28克三水合磷酸氢二钾溶于水中，稀释至
100 mL；将第二溶液的pH调节至
7.6 使用第一种解决方案。
二硫苏糖醇溶液：浓度为0.194 M，制备方法如下：将60 mg二硫苏糖醇（DTT）溶解于2 mL磷酸钾缓冲液中。
氯化钙溶液：0.01 M，制备方法如下：将147 mg二水合氯化钙溶于100 mL水中。
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作者：安心365
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大小：1.08MB
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时间：2026-04-30
