美国药典 USP 2025〈64〉 益生菌测试.pdf

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状态：当前状态为正式生效，生效日期为2025年2月12日
生效日期：自2024年3月1日起生效
文件类型：通用章节
文档ID：GUID-804A3FF9-39F3-4C5D-A4B0-2A387EF95F96_3_en-US
DOI：https://doi.org/10.31003/ USPNF_M11076_03_01
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〈64〉 益生菌测试
引言
本章规定了益生菌的鉴定、计数、污染检测及其他相关要求的测试程序。益生菌是活微生物，当以足量摄入时，可为主机带来健
康益处。益生菌通常在菌株水平进行鉴定，因为其特性具有菌株特异性。
本章适用于在专用发酵罐中、严格卫生条件下生产、用于膳食补充剂或制药用途的益生菌。发酵培养基根据微生物种类或菌株的具体需
求进行定制，通常含有蛋白质、碳水化合物、维生素和矿物质等营养成分。培养物在严格规定的条件下进行增殖和生长。微生物细胞生长
完成后，通常通过离心法收集培养细胞。可在浓缩的益生菌微生物（生物质）中添加适宜的保护剂，随后将生物质冷冻干燥或喷雾干燥制
成粉末状。干燥后的生物质需进行配方加工，这可能涉及将一种或多种菌株与适宜的辅料混合。制备好的益生菌成分可进一步加工成不同
剂型，例如片剂、胶囊、软胶囊、粉末或凝胶。
修改为：
识别；鉴定
根据本章定义，益生菌可根据专著要求在属种水平、物种水平或菌株水平进行鉴定。由于商业益生菌的监管申报通常基于菌株水平，并
辅以安全性评估和人体研究数据，因此可能需要通过菌株水平鉴定来验证商业产品标签中标注的菌株信息。本章推荐采用聚合酶链式反应
（PCR）结合菌株特异性引物进行菌株特异性鉴定以确认益生菌身份。目前，本章已列出使用特异性引物通过PCR鉴定乳酸杆菌和双歧
杆菌菌株的检测方法。针对非产孢细菌、产孢细菌以及酵母或霉菌等益生菌菌株的其他鉴定方法，将在相关技术成熟后另行收录于本章。
非产孢细菌菌株的鉴定
采用特异性引物通过PCR鉴定乳酸杆菌和双歧杆菌菌株
除非各专著另有规定，否则应遵循以下通用程序。本试验所用的所有试剂和溶液均应为分子生物学级。
▲
▲
缓冲液：Tris-EDTA 缓冲液，pH 8.0 TS （2024年3月1日）
PCR预混液：Taq DNA聚合酶（62.5 U/mL）、2.5倍浓度的Taq反应缓冲液[125 mM氯化钾（氯化钾）、75 mM三羟甲基氨基甲烷盐酸
盐，pH 8.3，以及4 mM镁离子（Mg²）]，以及每种脱氧核苷酸（dNTP）500 µM 。制备好的PCR预混液溶液均为市售产品。
样本：益生菌粉末在缓冲液中配制成100 mg/mL的悬浮液
引物组：使用各专论中指定菌株对应的引物。将正向和反向引物用缓冲液稀释至储备浓度为100 µM ，再用缓冲液进一步稀释至25 µM 。稀
释后的正向引物和反向引物25 µM 溶液可保存于−20°C。
▲
PCR样本制备：对于每套引物，制备一份溶液，其中包含1 µL 样本、10 µL PCR预混液、1 µL 稀释后的正向引物（25 µM）、1µL稀
释后的反向引物（25 µM）以及12 µL 无DNase/RNase的水。▲(IRA 1-3月-2024年)
▲▲PCR阴性对照：按照PCR样本制备说明进行操作，但将样本替换为1 µL 的水（不含DNase/RNase）。（IRA 1-Mar-）
PCR阳性对照（如可用）：按PCR样本制备说明进行操作，但需将样本替换为1µL相应的参考标准品。
分析：使用合适的热循环仪对每个PCR样本制备物、PCR阴性对照和PCR阳性对照进行PCR扩增。 除非各专论另有规定，直接热诱导
DNA提取时需在95°C下孵育7分钟（步骤1）。
▲
热循环程序：95°C保持30秒（步骤2）；退火温度按各专论规定条件进行30秒（步骤3）；72°C保持30秒（步骤4）。重复步骤2–4共30至34次循
环，随后在72°C孵育5分钟，最后于4°C保存。对所有PCR样本制备物、PCR阴性对照及PCR阳性对照 的PCR扩增产物进行电泳分离。
OFFICIAL
2025年2月12日下午2:13 USP- NF 〈64〉 益生菌测试
▲合适的方法。建议的系统包括自动化片上电泳系统、自动化毛细管电泳系统或等效系统。 （IRA 1-2024年3月-）
准备或使用市售的1%（w/v）琼脂糖凝胶，该凝胶溶解于1X Tris-乙酸–缓冲液（含40 mM Tris盐酸盐、1%冰醋酸及1 mM
）。用含0.5 mg/mL溴化乙锭的水溶液对凝胶进行染色，随后用水脱色。[注意：溴化乙锭属于有毒物质且可能具有致突变性。
操作该试剂时须使用适当的个人防护装备（包括丁腈手套）。]
应使用适用于测定100至12,000个碱基对之间线性双链DNA片段大小的DNA梯度标准品（1 KB及以上） 。该梯度标准品需置于
凝胶的首条和末条泳道中，以便对扩增产物进行准确比对。PCR阴性对照的分析结果必须显示无任何扩增产物；若出现扩增现象，
则需重复PCR样本制备及阴性对照步骤，随后进行PCR扩增与分析。
验收标准：参见各专论中的验收标准。
修改为：
列举法
本章目前列出了针对乳酸杆菌属（Lactobacillus）和双歧杆菌属（Bifidobacterium）菌种的特异性计数检测方法。针对益生菌菌株（包
括其他非产芽孢细菌、产芽孢细菌以及酵母菌和霉菌）的其他计数检测方法，将在相关方法正式发布后列入本章。若已证明其等效性，可
采用替代性微生物学检测方法（包括自动化检测方法）。
非产孢细菌菌株的列举
乳酸杆菌属和双歧杆菌属物种
除非各专著另有规定，否则应遵循以下通用程序。
乳酸杆菌MRS琼脂（适用于
乳酸杆菌
和
双歧杆菌
菌种的培养基）：按表1制备，或使用市售混合培养基。
表1. 乳酸杆菌MRS琼脂
试剂
数量
蛋白胨培养基 #3
牛肉提取物
酵母提取物
葡萄糖
聚山梨酯80
柠檬酸铵
乙酸钠
硫酸镁
硫酸锰
磷酸二钾
琼脂
适用于微生物学分析的蛋白胨可从BD Bacto（ ）购买。
合适的硫酸锰可从Sigma-Aldrich公司（ ）购买。
将乳酸杆菌MRS琼脂悬浮于1升纯化水中，置于合适尺寸的锥形瓶或烧杯内（容量需足够大以防止溢出）。用铝箔覆盖容器，在热板上加
热并搅拌至沸腾。持续煮沸1分钟使培养基完全溶解，随后在121℃条件下对溶液进行15分钟高压灭菌。冷却至45℃后立即使用。煮沸后
的琼脂培养基也可无菌转移至100或200毫升分装瓶中进行灭菌，随后高压灭菌并储存以备后续使用。除非计划立即使用，否则琼脂应储
存于2°C至8°C的无菌密封容器中。切勿将培养基储存时间超过经验证的有效期限。使用前需待琼脂恢复至室温。
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2025年2月12日下午2:13 USP- NF 〈64〉 益生菌测试
乳酸杆菌MRS肉汤：按表2制备，或使用合适的市售肉汤。
表2. 乳酸杆菌MRS肉汤
试剂
数量
蛋白胨培养基 #3
牛肉提取物
酵母提取物
葡萄糖
聚山梨酯80
柠檬酸铵
乙酸钠
硫酸镁
硫酸锰
磷酸二钾
适用于微生物学分析的蛋白胨可从BD Bacto（ ）购买。
合适的硫酸锰可从Sigma-Aldrich公司（ ）购买。
将乳酸杆菌MRS肉汤悬浮于1升纯化水中，置于合适尺寸的锥形瓶或烧杯内（容量需足够大以防止溢出）。用铝箔覆盖容器，在热板
上加热并搅拌至沸腾。继续煮沸1分钟使肉汤成分完全溶解，随后在121℃条件下对溶液进行15分钟高压灭菌。也可将肉汤分装至100
或200毫升的独立培养基瓶中进行无菌转移，灭菌后高压灭菌并储存以备后续使用。除非计划立即使用，否则肉汤应储存于2°C至8°C
的无菌密封容器中。切勿超过经验证的有效储存期限使用该培养基。使用前请让肉汤恢复至室温。
蛋白胨稀释液：将0.1%的蛋白胨 溶于水（w/v）中，用乳酸溶液调节pH至7.0。使用高压灭菌器在121°C下对溶液进行15分钟的蒸汽灭
菌，随后在未开启的高压灭菌器中冷却。根据需要分装至无菌容器中用于制备样品。
▲
样品制备：除非各专论另有规定，将相当于11.0克的益生菌粉末转移至无菌聚乙烯袋中（该袋在商业上称为stomacher袋），加入99毫升经
预先灭菌（室温）的乳酸杆菌MRS肉汤。使用机械搅拌器混合至均匀，或使用stomacher 以230 rpm速度搅拌30秒 （用于双歧杆菌）或
2分钟（用于乳酸杆菌）。 ▲
▲
（IRA 1-3月-2024年）将混合物置于室温下静置30分钟，使样品充分复水，随后以230 rpm的速度继续混合30秒
（双歧杆菌）；若为乳酸杆菌，则混合2分钟。 ▲(IRA 1-3月-2024年)这是初始的10 稀释液。使用经灭菌过滤的移液枪头，通过无菌转
移1.0 mL初始10 稀释液至无菌培养基瓶中（每瓶含99.0 mL蛋白胨稀释液，即10 稀释度），进行系列稀释。重复此操作直至获得所
需稀释梯度。稀释后的菌液浓度应为25–250 cfu/mL。进行分析前需摇匀培养基瓶以充分混合。
▲
分析：使用三个无菌过滤的1 mL移液枪头，无菌条件下分别将1.0 mL样品制备液转移至三个适当标记的无菌15毫米×100毫米培养皿中，随
后在约45°C下向每皿浇注约10–15 mL乳酸杆菌MRS琼脂，并在每次浇注后用火焰轻摇瓶口。加入琼脂培养基后盖上每皿盖子，轻轻旋
转培养皿以混合样品制备液与琼脂培养基。旋转培养皿时避免琼脂溢出至培养皿盖上。对样品制备液进行后续稀释时重复此步骤。制备
仅含乳酸杆菌MRS琼脂的空白培养皿，以及第二个空白培养皿，其中含1.0 mL蛋白胨稀释液与乳酸杆菌MRS琼脂混合。将培养皿置于室
温水平面上静置直至琼脂凝固，随后在厌氧条件下于 38 ± 1°C培养2–3天（IRA 1-Mar-） 。培养结束后计数菌落，并记录每克活
菌形成单位（cfu）的结果，同时考虑近样本制备的原始稀释倍数。仅计数含有25–250个菌落的平板。测定平板平均菌落数，单位为cfu/
g。
验收标准：参见各专论中的验收标准。
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标签： #测试 #USP

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状态：当前状态为正式生效，生效日期为2025年2月12日生效日期：自2024年3月1日起生效文件类型：通用章节文档ID：GUID-804A3FF9-39F3-4C5D-A4B0-2A387EF95F96_3_en-USDOI：https://doi.org/10.31003/USPNF_M11076_03_01DOIRef:0olhj©2025USPC请勿分发〈64〉益生菌测试引言本章规定了益生菌的鉴定、计数、污染检测及其他相关要求的测试程序。益生菌是活微生物，当以足量摄入时，可为主机带来健康益处。益生菌通常在菌株水平进行鉴定，因为其特性具有菌株特异性。本章适用于在专用发酵罐中、严格卫生条件下...

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