美国药典 USP 2025〈63〉支原体检测

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状态：当前状态为正式生效，生效日期为2025年2月12日
官方日期：2013年之前的官方日期
文件类型：通用章节
DocId：GUID-05436D42-6984-45C8-9A43- 490147FE118A_1（英文版本）
DOI：https://doi.org/10.31003/ USPNF_M3687_01_01
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〈63〉支原体检测
引言
支原体属（Mycoplasma）代表一类没有细胞壁的微小细菌。该属包含120多种物种，是目前已知最小的能够自我复制的原核生物。其细胞
大小和形态各异，无法通过革兰氏染色法进行观察；但固体琼脂上的菌落印迹可使用亚甲蓝或等效染色剂进行染色。支原体既可作为寄生菌，
也可作为共生菌存在，其中部分菌种对多种动植物宿主具有致病性。在人类体内，支原体通常为表面寄生菌，定植于呼吸道和泌尿生殖道的上
皮衬里。支原体普遍存在，可能对用于生产药典制品的细胞和/或组织培养物造成严重污染；同时亦可污染经过滤灭菌的大豆酪蛋白消化液培
养基。细胞培养中的感染可能长期持续存在而不引起明显的细胞损伤。培养物中细胞的感染可影响细胞代谢的几乎所有途径，包括改变细胞的
表型特征及正常生长。支原体属菌种的存在并不总是导致培养物出现浑浊生长或细胞可见形态改变。
支原体检测是确保生物技术产品及其生产所用相关材料具有可靠纯度的必要质量控制要求。本通用测试章节阐述了两种用于检测受试品、生
产受试品所用组织和/或细胞培养物、消化肉汤或任何疑似存在支原体污染的材料中支原体污染的方法：(A)琼脂与肉汤培养基法；(B)指示细胞
培养法。这些检测需严格遵循无菌操作规范并具备适宜的实验室条件。为确保检测过程及结果解读的准确性，操作人员必须接受专业培训并具
备相应资质。可采用经验证的核酸扩增技术（NAT）或基于酶活性的方法检测支原体，前提是该方法经证实与(A)和(B)两种方法具有可比性。
替代方法必须经过充分验证，但本章不涉及替代方法的验证要求。
培养方法
媒体选择
该检测需使用足量的固体和液体培养基，以确保在选定的培养条件下，能够培养出受试品/材料中可能存在的少量支原体（约100菌落形成单
位，cfu；或100变色单位，ccu）。液体培养基必须含有酚红。所选培养基系列对《质量控制测试菌株》（详见下文）中列出的微生物至少具
有理想的营养特性。每批新培养基的营养特性均需针对清单中的相应微生物进行验证。支原体检测时，每项测试至少应包含两种已知支原体菌
种或菌株（列于《质量控制测试菌株》）作为阳性对照：其中一种应为葡萄糖发酵菌（如肺炎支原体或同等菌种），另一种应为精氨酸水解菌
（如口腔支原体或同等菌种）。仅在检测昆虫细胞系时，才需加入螺旋体对照菌株（例如柑橘螺旋体 ATCC 29747、蜜蜂螺旋体 ATCC 29416
或同等菌种）。此外，这些菌株对营养需求可能更为苛刻。它们所需的培养温度较低（与昆虫细胞系相同）。
质量控制测试菌株生物体
阳性对照培养物的传代次数自分离起不得超过15代。适用于使用的支原体物种或菌株如下所列：
莱氏阿霍尔普拉姆菌（当生产过程中使用抗生素时，适用于人类和兽医用途的疫苗和/或细胞源性材料/培养物）
鸡致病性杆菌（当生产过程中使用禽类材料，或当疫苗或细胞培养物拟用于家禽时）
M. hyorhinis（非禽类兽用疫苗或细胞培养物）
口服疫苗（供人类和兽医使用）
肺炎支原体（供人类使用的疫苗或细胞库）或其他合适的D-葡萄糖发酵菌种，例如发酵支原体（M. fermentans）
M. synoviae（当生产过程中使用禽类材料，或当疫苗或细胞库拟用于家禽时）
测试菌株可以是田间分离株，这些菌株仅经过有限次数的传代培养（不超过15次），采用冷冻（-20°C或更低温度）或冻干方式保存，并通
过与模式菌株（例如表所示菌株）比对，确认其属于所需菌种。
表1. 用于鉴定田间分离株并作为测试菌株的类型培养物
OFFICIAL
2025年2月12日下午2:12 USP- NF 〈63〉支原体检测
测试生物体 NCTC 编号 CIP编号 ATCC 编号
口服M
肺炎支原体
培养条件
液体培养基需置于密封容器中，在36 ± 1 °C条件下培养。固体培养基则需在微需氧条件下培养（氢气氛围中氧气含量低于0.5%，和/或含
5%–10%二氧化碳的氮气环境中）。培养过程中应保持足够的湿度，以防止琼脂表面在36 ± 1 °C下发生干燥。
营养特性
对每批新配制的培养基均需进行营养特性测试。将选定的培养基接种相应的测试微生物；每块含有至少9 mL固体培养基的平板及每100 mL
液体培养基容器中，接种量不得超过100 CFU；不同微生物种类需使用独立的平板和容器。按指定时间间隔（详见下文“受试品/材料中的支
原体检测”部分），将培养基置于培养箱中培养，并从0.2 mL液体培养基中取样接种至固体培养基进行传代培养。若所有测试微生物的菌落数
均在接种量的0.5个对数单位范围内，则固体培养基符合测试要求；若从肉汤培养基传代培养的琼脂平板上，每种测试微生物至少有一个传代
培养物出现生长，则液体培养基符合测试要求。使用100倍及以上放大倍数的显微镜可辅助检测。
抑制性物质
抑制性物质检测针对特定产品仅进行一次，当生产方法发生可能影响支原体检测的变更时需重复检测。为证明无抑制性物质存在，应在添加
和不添加受试物/材料的情况下分别进行营养特性检测。若在未添加受试物/材料时，受试微生物的生长时间较添加时提前超过1个传代，则表
明存在抑制性物质。同样地，若直接接种受试物/材料的平板所形成的菌落数与未添加受试物/材料接种的平板菌落数相差超过0.5个对数单位，
则亦属抑制性物质存在。在这两种情况下，必须采用适当方法（例如在不含抑制剂的培养基中传代或在更大体积培养基中稀释）对抑制性物质
进行中和或抵消其效应，方可进行检测。若采用稀释法，则可使用更大体积的培养基或将接种物分装至多个100 mL锥形瓶中。通过在中和后
重复进行抑制性物质检测，可验证中和或其他处理方法的有效性。
受试物/材料中的支原体检测
结果解读
在规定的培养期结束时，应对所有接种的固体培养基进行支原体菌落检测。若未出现典型的支原体菌落生长，则产品符合检测要求；若在任
一固体培养基上出现典型的支原体菌落生长，则产品不符合检测要求。若一个或多个阳性对照在至少一个传代平板上未显示支原体生长，则检
测结果无效；若一个或多个阴性对照出现支原体生长，则检测结果无效。若观察到可疑菌落，应采用经验证的合适方法确认其是否由支原体引
起。
每100 mL液体培养基中需接种不少于10 mL受试物/材料。若添加受试物/材料后pH值发生显著变化，可通过加入无菌的氢氧化钠或盐酸溶液
使液体培养基恢复至原始pH值。每块固体培养基平板需接种0.2 mL受试物/材料。液体培养基培养时间为20–21天；固体培养基培养时间不少
于14天（但对应20–21天传代培养的平板需培养7天）。同时，将每份液体培养基和琼脂平板的未接种100 mL部分作为阴性对照进行培养。接
种后第2–4天，通过在每块固体培养基平板上接种0.2 mL液体培养基进行传代培养。在试验的第6至8天、第13至15天及第19至21天重复上述操
作。每2或3天观察一次液体培养基，若出现颜色变化则进行传代培养。若液体培养基出现细菌或真菌污染，则试验结果无效；若每种培养基及
每个接种日至少有一块平板可读取结果，则试验有效。测试阳性对照应通过在琼脂培养基或肉汤培养基上接种不超过100 CFU的至少一种测试
微生物制备。若定期进行支原体检测，建议定期轮换使用不同的测试微生物。所使用的测试微生物应符合“培养基选择”部分列出的种类。将
肉汤培养基和平板置于湿润环境中，维持微需氧条件（ ）进行培养。
OFFICIAL
2025年2月12日下午2:12 USP- NF 〈63〉支原体检测
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【注：本节仅作参考用途。】
解决方案
牛肉心高汤
牛心（用于制备输液）
蛋白胨
氯化钠
蒸馏水 至1000毫升
必需维生素
生物素 100毫克
泛酸钙 100毫克
氯化胆碱 100毫克
叶酸 100毫克
i-肌醇 200毫克
烟酰胺 100毫克
盐酸吡哆醛 100毫克
核黄素 10毫克
盐酸硫胺素 100毫克
蒸馏水 至1000毫升
琼脂，纯化过的
这是一种专为微生物学和免疫学研究设计的高度纯化琼脂，采用离子交换法制备，所得产品具有卓越的纯度、透明度及凝胶强度。其成分包括：
水
灰烬
酸不溶性灰分
氯
总氮
铜
钢铁
钙
镁
汉克斯平衡盐溶液（改良版）
磷酸盐（按 计算）
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