美国药典 USP 2025〈71〉无菌试验

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状态：当前状态为正式生效，生效日期为2025年2月12日
官方日期：2013年之前的官方日期
文件类型：通用章节
DocId：GUID-481C30EA-8A49-4A77-9E81- D0CD7C533498_1（英文版本）
DOI：https://doi.org/10.31003/ USPNF_M98810_01_01
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〈71〉无菌试验
⧫本总则章节的部分内容已与《欧洲药典》和/或《日本药典》的相应条文保持一致。未与之统一的部分均以符号（◆）标示，以明确这一事实。
这些药典程序本身并非旨在确保某批次产品达到无菌状态或已完成灭菌处理。这一目标主要通过验证灭菌工艺或无菌加工程序来实现。
本检测适用于根据《药典》规定需达到无菌标准的物质、制剂或制品。然而，仅当检测结果令人满意时，方可表明在测试条件下所检样品
中未发现污染微生物。
防止微生物污染的注意事项
无菌性检测应在无菌条件下进行。为实现这一条件，检测环境必须根据无菌检测的具体操作方式进行相应调整。所采取的防污染措施不得
对检测中需检出的任何微生物产生影响。检测实施的工作环境需通过定期对工作区域进行适当采样及实施相应质量控制措施来持续监测。
培养基与培养温度
测试所用培养基可按以下方法制备，或使用等效的商业培养基，前提是其符合需氧菌、厌氧菌及真菌生长促进试验的要求。
以下培养基已被证实适用于无菌性检测。流体硫乙醇酸盐培养基主要用于厌氧菌的培养，但也能检测需氧菌。大豆-酪蛋白消化培养基适用
于真菌和需氧菌的培养。
硫代乙醇酸盐液体培养基
L-胱氨酸
氯化钠
一水葡萄糖/无水
琼脂
酵母提取物（水溶性）
酪蛋白胰酶消化液
硫代乙醇酸钠
或硫乙醇酸 0.3 毫升
雷扎素钠溶液（1:1000），新鲜配制 1 0 毫升
纯化水 1000毫升
灭菌后pH值：7.1±0.2。
将L-胱氨酸、琼脂、氯化钠、葡萄糖、酵母提取物及酪蛋白胰酶消化液与纯化水混合，加热至溶液完全溶解。将硫乙醇酸钠或硫乙醇酸溶解
于溶液中，必要时加入1N氢氧化钠，使灭菌后溶液的pH值达到7.1 ± 0.2。如需过滤，再次加热溶液（避免沸腾），并在热状态下通过湿润滤
纸过滤。加入重氮蓝钠溶液，混匀后将培养基置于合适的容器中，确保培养基表层与深度的比例使得孵育结束时不超过上半部分培养基出现指
示氧气吸收的颜色变化。采用经验证的灭菌流程进行灭菌。若需储存培养基，应置于2°至25°的无菌密闭容器中保存。若超过上三分之一的培
养基呈现粉红色，则可进行一次恢复处理。
⧫ ⧫
OFFICIAL
2025年2月12日下午2:14 USP- NF 〈71〉 无菌试验
将容器置于水浴或自由流动的蒸汽中加热，直至粉红色消失，随后迅速冷却，并注意防止非无菌空气进入容器。该培养基的储存期限不得超过已验证的有效
期。
硫乙醇酸盐液体培养基需在30°–35°条件下孵育。对于含有无法通过膜过滤法检测的汞类防腐剂的产品，可使用在20°–25°下孵育的硫乙醇酸
盐液体培养基替代大豆-酪蛋白消化培养基，前提是该培养基已按照《需氧菌、厌氧菌及真菌生长促进试验》所述方法完成验证。在有明确规
定、合理依据且获得授权的情况下，可使用以下替代性硫乙醇酸盐培养基：配制成分与硫乙醇酸盐液体培养基相同的混合液，但省略琼脂和亚
甲蓝钠溶液；按上述方法进行灭菌处理。灭菌后的pH值为
7.1 ± 0.2。使用前置于水浴中加热，并在厌氧条件下于30°–35°C条件下孵育。
大豆-酪蛋白消化培养基
酪蛋白胰酶消化液
大豆粕的Papaic消化液处理工艺
氯化钠
双基磷酸钾
一水葡萄糖/无水
纯化水 1000毫升
灭菌后pH值：7.3±0.2。
将固体溶解于纯化水中，轻微加热使其形成溶液。将溶液冷却至室温，并用1 N氢氧化钠调节pH值，确保灭菌后pH值为7.3 ± 0.2。必要时过
滤以澄清溶液，分装至合适的容器中，并采用经验证的方法进行灭菌。除非计划立即使用，否则应储存于2°C至25°C的无菌密封容器中。不得
将该培养基储存超过经验证的有效期限。
大豆-酪蛋白消化培养基需在22.5 ± 2.5°C条件下培养。
⧫青霉素或头孢菌素的载体
在采用“培养基直接接种法”对待检产品进行无菌性检测时，若需使用无菌试验培养基，应按以下方式修改流体硫乙醇酸盐培养基和大豆-
酪蛋白消化培养基的配制方法：向各培养基容器中无菌转移足量 β-内酰胺酶，以灭活待检样本中的抗生素含量。需使用经预先测定具有青霉
素或头孢菌素灭活能力的 β-内酰胺酶制剂，确定灭活抗生素所需的 β-内酰胺酶用量。[注：补充型 β-内酰胺酶培养基也可用于膜过滤试验。]
或者（在与无菌检测区域完全独立的区域），按照方法适用性测试中的任一方法，使用少于100菌落形成单位（cfu）的金黄色葡萄球菌（参
见表1）作为挑战菌株，确认培养基中已加入适量的 β-内酰胺酶。必须观察到接种培养物中典型的微生物生长，以确认 β-内酰胺酶浓度适
宜。
表1. 适用于生长促进试验及方法适用性试验的测试微生物菌株
需氧菌
金黄色酿脓葡萄球菌 ATCC 6538，CIP 4.83，NCTC 10788，NCIMB 9518，NBRC 13276
枯草芽孢杆菌 ATCC 6633，CIP 52.62，NCIMB 8054，NBRC 3134
⧫
铜绿假单胞菌 ATCC 9027，NCIMB 8626，CIP 82.1 18，NBRC 13275
厌氧菌
⧫
产孢梭菌 ATCC 19404，CIP 79.3，NCTC 532 或ATCC 1 1437，NBRC 14293
真菌
白念珠菌 ATCC 10231 ，IP地址：48.72，NCPF 3179，NBRC 1594
⧫
⧫
⧫
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2025年2月12日下午2:14 USP- NF 〈71〉 无菌试验
巴西曲霉
（黑曲霉） ATCC 16404，IP 1431 .83，IMI 149007，NBRC 9455
⧫另一种微生物是嗜根克氏菌（Micrococcus luteus）ATCC 9341。
⧫作为产芽孢梭菌的替代菌种，当需要非产孢微生物时，可选用普通拟杆菌（ATCC 8482）。
所使用的介质需符合以下测试要求，这些测试应在待检产品测试之前或与之同步进行。
无菌性
将培养基分装后孵育14天。未观察到微生物生长。
需氧菌、厌氧菌及真菌的生长促进试验
对每批预配培养基以及每批由脱水培养基或原料制备的培养基均进行测试。表1列出了适用的微生物菌株。
在流体硫乙醇酸盐培养基中接种少量（不超过100 cfu）以下微生物，每种微生物均使用单独的培养基部分：产孢梭菌、铜绿假单胞菌和金
黄色葡萄球菌。◆在替代硫乙醇酸盐培养基中接种少量（不超过100 cfu）梭菌。
针对以下各微生物物种，需使用不同的培养基部分：巴西曲霉（Aspergillus brasiliensis）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和白色念珠菌
（Candida albicans）。细菌培养时间不得超过3天，真菌培养时间不得超过5天。采用种子批次培养维持技术（种子批次系统），以确保用
于接种的活微生物与原始主种子批次的传代次数不超过五代。
当微生物出现明显可见的生长时，该培养基适用。
⧫用于膜过滤的稀释与冲洗液
流体A
制备
将1克动物组织的胃蛋白酶消化产物溶于水中制成1升溶液，必要时过滤或离心澄清，并调节pH至7.1 ± 0.2。分装至容器中，并采用经验证的方法
进行灭菌。
PENICILLINS 或CEPHALOSPORINS 的准备工作
如必要，可在上述制剂中无菌加入足量无菌 β-内酰胺酶，以灭活测试样本溶液过滤后膜上残留的任何抗生素活性（详见青霉素或头孢菌素培养
基说明）。
流体D
向每升流体A中加入1毫升聚山梨酯80，调节pH至7.1 ± 0.2，分装至容器中，并采用经验证的灭菌流程进行灭菌。该液体适用于含有卵磷脂或油
脂的制品，或标有“无菌路径”的医疗器械。
液体K
将5.0克动物组织的胃蛋白酶消化产物、3.0克牛肉提取物和10.0克聚山梨酯80溶于水中，制成1升溶液。调节pH值，使灭菌后的pH值达到6.9 ± 0.2。
分装至容器中，并采用经验证的灭菌流程进行灭菌。
方法适用性测试
按照下文所述“待检产品无菌性检测”部分所述方法进行测试，除以下修改外，其余操作均完全相同。
膜过滤
将待测容器的内容物转移至膜后，向用于冲洗滤膜的无菌稀释液剩余部分中加入少量活微生物接种物（不超过100 cfu）。
直接接种
将待检测容器（用于兽医用途的肠线及其他外科缝合线：线段）内的内容物转移至培养基后，向培养基中加入少量活微生物接种物（不超过
100 cfu）。
在这两种情况下，均应使用与上述需氧菌、厌氧菌及真菌生长促进试验中所述相同的微生物。需进行生长促进试验作为阳性对照。所有
含有培养基的容器培养时间不得超过5天。
若孵育后观察到微生物生长明显可见，且其程度与不含产品的对照容器中的生长情况视觉上可比，则表明该产品在测试条件下不具
备抗菌活性，或此类活性已被有效消除。此时即可直接进行无菌性检测，无需进一步修改。
若在待测产品存在条件下未观察到明显生长现象，且该生长情况与未添加产品的对照容器中的生长情况在视觉上可比，则表明该产品具
有在测试条件下未能被有效消除的抗菌活性。需调整测试条件以消除该抗菌活性，并重复进行方法适用性试验。
⧫
⧫
产孢菌。将少量（不超过100 cfu）以下菌株接种于大豆-酪蛋白消化培养基中：◆
⧫
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标签： #无菌 #USP #试验

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