美国药典 USP 2025〈61〉非无菌产品的微生物学检测：微生物计数试验
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状态：当前状态为正式生效，生效日期为2025年2月12日
官方日期：2013年之前的官方日期
文件类型：通用章节
DocId：GUID-0392F79D-1F8A-4B8D-BEC8- C6FD7B39966F_1（英文版本）
DOI：https://doi.org/10.31003/ USPNF_M98800_01_01
DOI 参考编号：to8bl
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〈61〉非无菌产品的微生物学检测：微生物计数试验
引言
下文所述的检测方法可对在需氧条件下生长的嗜温细菌和真菌进行定量计数。
这些检测主要用于确定某种物质或制剂是否符合既定的微生物质量标准。在用于此类目的时，请遵循以下说明（包括需采集的样本数
量），并按以下方法解读检测结果。
本方法不适用于以活微生物作为活性成分的产品。
可采用替代性微生物学检测方法（包括自动化方法），但须证明其与药典方法具有等效性。
一般程序
应在避免待检产品受到外部微生物污染的条件下进行检测。所采取的防污染措施必须确保不会影响测试中需检测的任何微生物。
若待检测产品具有抗菌活性，则应尽可能将其去除或中和。若采用灭活剂实现此目的，则必须证明其有效性及对微生物无毒性。
若使用表面活性物质进行样本制备，必须证明其对微生物无毒性，且与所使用的任何灭活剂相容。
列举法
按照操作指南，采用膜过滤法或其中一种平板计数法。最可能数（MPN）法通常是对微生物计数准确性最低的方法；然而，对于生物负载
极低的某些产品类别，该方法可能是最适宜的选择。
方法的选择基于产品性质及所需微生物限度等因素。所选方法必须能够检测足够数量的样本，以判断是否符合质量标准。必须确认所选方
法的适用性。
生长促进试验、计数方法的适用性及阴性对照的一般考量
必须确定该检测方法在待测产品存在条件下检测微生物的能力。
若对测试性能或产品进行了可能影响测试结果的变更，则必须确认其适用性。
测试菌株的制备
使用标准化的稳定测试菌株悬浮液，或按以下方法制备。采用种子批次培养维持技术（种子批次系统），以确保用于接种的活微生物与原始
主种子批次的传代次数不超过五代。按表1所述方法分别培养各细菌和真菌测试菌株。
表1. 测试微生物的制备与使用
生长促进 产品存在情况下计数方法的适用性
微生物
测试准备
菌株；变种
总需氧量
微生物计数
总酵母菌数量：
霉菌计数
总需氧量
微生物计数
总酵母菌数量：
霉菌计数
金黄色葡萄球菌，例
如ATCC 6538、
NCIMB
大豆-酪蛋白
消化琼脂或
大豆-酪蛋白
消化液 broth
大豆-酪蛋白
消化琼脂与……
大豆-酪蛋白
消化液 broth
大豆-酪蛋白
消化琼脂/ MPN
大豆-酪蛋白
消化液 broth
OFFICIAL
2025年2月12日下午2:11 USP- NF 〈61〉非无菌产品的微生物学检验：微生物计数试验
生长促进 产品存在情况下计数方法的适用性
微生物 测试菌株的制备 总需氧量
微生物计数
总酵母菌数量：
霉菌计数
总需氧量
微生物计数
总酵母菌数量：
霉菌计数
9518、CIP 4.83 或
NBRC 13276 18–24小时
100 CFU
3天
100 CFU
3天
铜绿假单胞菌，例如
ATCC 9027、NC-
IMB 8626、CIP 82.1
18或NBRC 13275
大豆-酪蛋白消化
琼脂或大豆-酪蛋
白 消 化 肉 汤 （ 温
度30°–35°）， 培
养时间18–24小时
大豆-酪蛋白
消化琼脂与……
大豆-酪 蛋白消 化
液 培 养 基 ：≤100
cfu（30°–35°C）
3天
大豆-酪蛋白
消化琼脂/ MPN
大豆-酪 蛋白消 化
液 培 养 基 ：≤100
cfu（30°–35°C）
3天
枯草芽孢杆菌，例如
ATCC 6633、NC-
IMB 8054、CIP
52.62或NBRC 3134
大豆-酪蛋白消化
琼脂或大豆-酪蛋
白 消 化 肉 汤 （ 温
度30°–35°）， 培
养时间18–24小时
大豆-酪蛋白
消化琼脂与……
大豆-酪 蛋白消 化
液 培 养 基 ：≤100
cfu（30°–35°C）
3天
大豆-酪蛋白
消化琼脂/ MPN
大豆-酪 蛋白消 化
液 培 养 基 ：≤100
cfu（30°–35°C）
3天
白 色 念 珠 菌 ， 例 如
ATCC 10231、
NCPF 3179、IP
48.72或NBRC 1594
沙氏葡萄糖琼脂或沙
氏葡萄糖肉汤（温度
范围：20°–25°）
2–3天
大豆-酪蛋白消化
琼 脂 ：≤100 cfu
（30°–35°）
5天
萨布罗德葡萄
糖 琼 脂 ≤100
cfu 20°–25°
5天
大豆-酪蛋白消化
琼 脂 ：≤100 cfu
（30°–35°）
5天
MPN ：不适用
萨布罗德葡萄
糖 琼 脂 ≤100
cfu 20°–25°
5天
巴 西 曲 霉 菌 ， 例 如
ATCC 16404、IMI
149007、IP1431.83
或NBRC 9455。
萨布罗德葡萄糖琼脂
或马铃薯-葡萄糖琼
脂 （20°–25°C） 培
养5–7天，或直至孢
子形成良好为止。
大豆-酪蛋白消化
琼 脂 ：≤100 cfu
（30°–35°）
5天
萨布罗德葡萄
糖 琼 脂 ≤100
cfu 20°–25°
5天
大豆-酪蛋白消化
琼 脂 ：≤100 cfu
（30°–35°）
5天
MPN ：不适用
萨布罗德葡萄
糖 琼 脂 ≤100
cfu 20°–25°
5天
使用pH 7.0的缓冲氯化钠-蛋白胨溶液或pH 7.2的磷酸盐缓冲溶液制备测试悬浮液；为使巴西放线菌（A. brasiliensis）孢子悬浮，可在缓
冲液中添加0.05%的聚山梨酯80。悬浮液应在2小时内使用，若储存于2°C至8°C条件下则可在24小时内使用。作为制备并稀释巴西放线菌或
枯草芽孢杆菌（B. subtilis）营养细胞新鲜悬浮液的替代方案，可先制备稳定的孢子悬浮液，随后取适量该孢子悬浮液用于测试接种。稳定
的孢子悬浮液可在2°C至8°C条件下保存经验证的时间段内。
阴性对照
为验证测试条件，需使用所选稀释剂替代测试制剂进行阴性对照实验。实验中不得出现微生物生长。在按照“产品测试”部分所述方法对
产品进行测试时，也必须进行阴性对照实验。若阴性对照实验失败，则需进行调查。
培养基的生长促进作用
对每批预配培养基以及每批由脱水培养基或所述原料制备的培养基均进行检测。
分别使用表1中指定的微生物（数量不超过100 cfu），接种到大豆-酪蛋白消化肉汤和大豆-酪蛋白消化琼脂的相应培养皿/平板上，并为每种
培养基准备独立的接种皿/平板。分别使用表1中指定的微生物（数量不超过100 cfu），接种到沙氏葡萄糖琼脂平板上，并为每种培养基准备独
立的接种平板。按表1所述条件进行培养。
对于固体培养基，所得生长结果与标准化接种物的计算值之间的差异不得超过2倍。对于新鲜制备的接种物，微生物的生长情况应与先前使用经测试且获
批的接种物所获得的结果相当。
OFFICIAL
2025年2月12日下午2:11 USP- NF 〈61〉非无菌产品的微生物学检验：微生物计数试验
当培养基批次出现时，若观察到的微生物生长情况与先前测试并通过批准的培养基批次所获得的结果相当，则可使用液体培养基。
计数方法在产品存在情况下的适用性
样品制备
样本制备方法取决于待测产品的物理特性。若以下所述任何操作步骤均无法达到满意效果，则必须制定合适的替代方案。
水溶性产品——将待检产品溶解或稀释（通常制备1:10的稀释液），使用pH 7.0的缓冲氯化钠-蛋白胨溶液、pH 7.2的磷酸盐缓冲溶液或大
豆-酪蛋白消化液。如有必要，可调节至pH 6至8。如需进一步稀释，可使用相同的稀释剂进行配制。
不溶于水的非脂肪产品——将待检产品（通常制备为1:10稀释液）悬浮于pH 7.0的缓冲氯化钠-蛋白胨溶液、pH 7.2的磷酸盐缓冲溶液或大
豆-酪蛋白消化液中。可添加表面活性剂（例如每升1克聚山梨酯80）以帮助悬浮难润湿物质。如有必要，可将pH调节至6至8。如需进一步
稀释，可使用相同稀释剂进行配制。
脂肪类制品——溶解于经过滤灭菌的肉豆蔻酸异丙酯中，或将待检产品与最低必要量的无菌聚山梨酯80或其他非抑制性无菌表面活性剂混
合；必要时，将混合物加热至不超过40°C，特殊情况下不超过45°C。仔细混合，并在必要时使用水浴维持温度。加入足量预热的指定稀释
剂，使原始产品浓度降至1:10。在维持温度的前提下，尽快完成混合以形成乳状液。可使用含有适当浓度无菌聚山梨酯80或其他非抑制性无
菌表面活性剂的指定稀释剂，进一步制备系列10倍稀释液。
气溶胶形式的液体或固体——无菌条件下将产品转移至膜过滤装置或无菌容器中以进行进一步采样。可使用每个受试容器中的全部内容物或规定
数量的定量剂量。
透皮贴剂——取下透皮贴剂的保护性覆盖片（“释放衬垫”），并将贴剂粘合面朝上置于无菌玻璃或塑料托盘上。用合适的无菌多孔材料
（例如无菌纱布）覆盖粘合面，以防止贴剂相互粘连，随后将贴剂转移至含有聚山梨酯80和/或卵磷脂等灭活剂的指定稀释液中。充分振荡
该制剂至少30分钟。
接种与稀释
在按上述方法制备的样品及对照组（不含测试物质）中，加入足量的微生物悬液，使接种量不超过100 cfu。接种悬液的体积不得超过稀
释后产品总体积的1%。
为证明产品具有可接受的微生物回收率，测试时必须使用制备样品的最低可能稀释倍数。若因抗菌活性或溶解度不佳而无法实现此条件，
则需制定相应的替代方案。若无法避免样品对微生物生长的抑制作用，可在中和、稀释或过滤后加入微生物悬液的等分试样。
抗菌活性的中和/消除
将按照“接种与稀释”部分所述方法稀释后的样品中回收的微生物数量，并按照“产品存在条件下微生物回收”部分所述程序进行培养
后，与对照样品中回收的微生物数量进行比较。
若生长受到抑制（抑制倍数大于2），则需对特定计数检测的操作流程进行调整，以确保结果的有效性。操作流程的调整可包括以下内
容：
1稀释剂或培养基体积的增加；
2. 将特定或通用的中和剂加入稀释剂中；
3. 膜过滤；或
4. 上述措施的综合运用。
中和剂——中和剂可用于中和抗菌剂的活性（参见表2）。可将其添加至所选稀释剂或培养基中，最好在灭菌前进行。若使用此类试剂，必
须通过设置含中和剂但不含产品的空白对照实验，证明其对微生物的有效性及无毒性。
表2. 常用中和剂/干扰物质处理方法
干扰物质
潜在中和作用
代理/方法
戊二醛、汞制剂 亚硫酸氢钠（亚硫酸氢钠）
酚类、酒精、醛类、山梨酸盐 稀释
醛类 甘氨酸
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作者：安心365
分类：专业资料
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属性：7 页
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格式：PDF
时间：2026-04-30
